生物碱提取方法的研究进展

生物碱提取方法的研究进展

氨基酸化合物是自然界中常见的含氮有机化合物。它们大多具有复杂的氮环结构、生理活性和碱性。这是许多中药和药物的有效成分。1水溶液中的原则生物碱的溶解性能是生物碱提取的重要依据之一。游离状态的生物碱根据溶解性能可分为亲脂性生物碱和水溶性生物碱两大类。亲脂性生物碱数目较多,绝大多数叔胺碱和仲胺碱都属于这一类。它们易溶于苯、乙醚、氯仿、卤代烷烃等极性较低的有机溶剂,在丙酮、乙醇、甲醇等亲水性有机溶剂中亦有较好的溶解度,而在水中溶解度较小或几乎不溶。水溶性生物碱主要是指季铵型生物碱,数目较少,它们易溶于水、酸水和碱水,在甲醇、乙醇和正丁醇等极性大的有机溶剂亦可溶解,但在低极性有机溶剂中几乎不溶解。具碱性的生物碱能和酸结合生成盐。生物碱盐一般易溶于水,难溶或不溶于亲脂性有机溶剂,但可溶于甲醇或乙醇。生物碱盐的水溶液加碱至碱性,则生物碱又以游离碱的形式存在。如亲脂性生物碱盐,则加碱后生成的游离碱又可自水溶液中沉淀析出。碱性极弱的生物碱和酸不易生成盐,仍以游离碱的形式存在,或生成的盐不稳定,其酸水液不需碱化,即可用氯仿提出游离碱。2氨基酸的提取传统的生物碱提取方法是建立在生物碱的理化性质,尤其是对于不同溶剂包括酸、碱等的溶解性能的基础上的。一般来说,除少数具有挥发性的生物碱可用水蒸气蒸馏法,具有升华性的生物碱可采用升华法提取外,绝大多数生物碱是利用溶剂提取法进行提取。提取过程一般由生物碱的粗提和纯化两个过程组成。2.1化合物的合成生物碱在溶剂中的溶解度直接与溶剂性质有关。一些常见溶剂按亲脂性的强弱顺序为:石油醚>苯>氯仿>乙醚>乙酸乙酯>丙酮>乙醇>甲醇>水。生物碱大部分是亲脂性化合物,而生物碱盐能够离子化,加大了极性,就会变成亲水化合物。当生物碱和生物碱盐与溶剂溶解性相当时,就会有较大的溶解度。按溶剂种类,可分为水或酸水提取法、醇类溶剂提取法、亲脂性有机溶剂提取法及其他溶剂提取法。(1)原则用碱提取碱具碱性的生物碱在植物体中多以盐的形式存在,而弱碱性或中性生物碱则以不稳定的盐或游离碱的形式存在。生物碱盐类一般不溶于亲脂性有机溶剂而溶于水或醇。用水作溶剂提取生物碱,植物体中一些亲脂性的弱碱或中性碱提取不完全或不被提出,但如用酸水提取,则使生物碱都以盐的形式被提出。故生物碱提取一般采取酸水作溶剂,较少采用水提取。酸水提取法常用0.5%～1%的乙酸、硫酸、盐酸或酒石酸等为溶剂。(2)提取溶剂的选择游离生物碱及盐类一般都能溶于甲醇和乙醇,因此它们作为生物碱的提取溶剂应用较为普遍。虽然甲醇比乙醇极性大,沸点低,对生物碱盐类的溶解性能比乙醇好,但它对视神经的毒性很大,所以除实验室有时用甲醇为生物碱提取溶剂外,多数用乙醇为溶剂,有时也用稀乙醇(60%～80%)作溶剂。也有采取酸性醇作提取溶剂。醇类溶剂提取液中除含有生物碱及其盐类外,尚含有大量的其他脂溶性杂质,用稀醇提取的还含有一些水溶性杂质,需进一步处理。(3)游离碱的提取大多数游离生物碱都是脂溶性的,因此可以用亲脂性有机溶剂,如氯仿、二氯甲烷或苯等提取。由于生物碱一般以盐的形式存在于植物细胞中,故采用亲脂性有机溶剂提取时,必须先使生物碱盐转变成游离碱,其方法是先将药材粉末用石灰乳、碳酸钠溶液或稀氨水等碱水湿润后再用溶剂提取。亲脂性有机溶剂提取法提出的总生物碱一般只含有亲脂性生物碱,不含水溶性生物碱。这种提取方法得到的总生物碱,杂质较少,易于进一步纯化。(4)提取溶剂的选择除了以上几种传统的溶剂提取方法外,为提高提取效率,根据生物碱的不同性质衍生出一些其他方法。如钟静芬等人用不同类型和浓度的表面活性剂对秦艽生物碱进行提取,结果表明,非离子型表面活性剂的水溶液能增加生物碱的提取率,尤其以0.5%TW80稀醇液的提取率最高,并大于95%乙醇液、水和酸水作溶剂的提取率。又如段光明、宗会研究了不同溶剂系统对马铃薯糖苷生物碱的提取效果,即单溶剂法(甲醇为溶剂)、双溶剂法(体积比为2:1的甲醇与氯仿)和混合溶剂法(体积比为50:30:20:1的四氢呋喃、水、乙腈及冰乙酸),结果表明,混合溶剂提取效果最好,提取率最高,双溶剂次之,单溶剂最低。另外,还可以将溶剂提取法与其他方法相结合。如正处在探索中的溶剂提取-超声波法,是以超声波辐射压强产生的骚动效应、空化效应和热效应引起机械搅拌,加速扩散溶解的一种新型提取方法。如郭孝武用溶剂提取-超声波法提取益母草总碱,并与热回流法相比较,发现超声波法所得益母草总生物碱的提出率高于热回流法,并且缩短了提取时间。按具体操作可分为浸渍法、渗漉法、热回流法、连续回流提取法和煎煮法。(1)甲基莲心碱的纯化浸渍法简便,是最常用的方法之一。它是将处理过的药材,用适当的溶剂在常温或温热(60～80℃)的情况下浸渍以溶出其中成分。如王嘉陵用甲醇浸泡莲子心粉,然后回收甲醇,用酸水、碱水、亲脂性溶剂进行纯化,非水溶性总碱(含莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱)收率为0.61%。又如张灿等人用酸水提取法从北豆根中提取蝙蝠葛总生物碱,即在30℃时用0.5%的硫酸溶液浸提,提取液用碳酸钠碱化调pH值至9,过滤干燥后得粗总碱。该法一般在常温下进行,对中药中有效成分尤其是热敏性物质的提取非常有利,但操作时间长,浸出效率差,用水为溶剂时提取液易腐败变质,须注意加入适当的防腐剂。(2)减少疗效,提高效成分的含量渗漉法是往药材粗粉中不断添加溶剂使其渗过粗粉,从渗漉筒下端流出浸液的方法。此方法浸出效果优于浸渍法,适用于有效成分含量较低或贵重药材的提取。如黄嘉诺采用不同浓度的乙醇作溶剂,从药材中提取延胡索生物碱,用渗漉法进行提取,并与热回流法进行比较,结果用同一浓度乙醇(50%)为溶剂,渗漉法提取的生物碱收率(0.221%)大于热回流法(0.191%)。但此法溶剂消耗量大,费时长,操作烦琐,且新鲜及易膨胀的药材和无组织结构的药材不宜用渗漉法。(3)提取萃取溶剂热回流法是一种比较成熟的分离方法。其最大特点在于通过溶剂的蒸发与回流,使得每次与原料相接触的溶剂都是纯溶剂,从而大大提高了萃取动力,达到提高萃取速度和效果的目的。如李文科从骆驼蓬中提取骆驼蓬生物碱,先用80%乙醇密闭浸泡原材料粗粉24h,热回流3h,过滤,反复提取3次,将滤液合并,回收乙醇得浸膏。再用氯仿提取法纯化浸膏,得总生物碱,回收率为3.46%。此法可减少溶剂消耗,提高浸出效率,但受热易破坏的成分不宜用此法。此外,溶剂消耗量大,操作复杂。(4)索氏提取单次提取为了弥补回流提取法中需要溶剂量大和操作复杂的不足,可采取连续回流提取法。实验室常用脂肪提取器或称索氏提取器,因此该方法又称索氏提取法。如甄攀、杨凤珍考察了吴茱萸总生物碱的提取条件,结果表明,在相同的提取时间内,索氏提取的效率高于浸渍提取和超声提取,与回流提取相当,而且回流提取需要分3次提取,操作麻烦,因此优选索氏提取。连续提取法提取液受热时间长,因此对受热易分解的成分不宜用此法。(5)中药质量判断是否为有效成分煎煮法是将中药粗粉加水加热煮沸,将中药成分提取出来的方法,此法简便,药中大部分成分可被不同程度地提出,但含挥发性成分及有效成分遇热易破坏的中药不宜用此法。如李成网等人将干燥山豆根粉末用8倍量水煎煮两次,滤过浓缩,加2倍量医用乙醇,静置24h,过滤,将滤液浓缩后用氯仿提取法纯化,所得回收率最高达1.35%,优于70%和95%乙醇的热回流法。2.2物碱及氧化物的纯化用溶剂直接提取出的粗生物碱除了含生物碱及盐类外,还含有大量其他脂溶性杂质或水溶性杂质,须进一步纯化处理,常见的有树脂法和有机溶剂萃取法。(1)总氧化物的提取树脂法包括离子交换树脂法和大孔树脂吸附法。离子交换树脂法通常是将提取液酸化后,通过强酸型(氢型)阳离子交换树脂柱,使生物碱盐阳离子交换在树脂上而与非碱性的化合物分离。对于亲脂性生物碱可采用氨液碱化树脂,使生物碱从交换树脂上以游离碱的形式游离出来,树脂晾干后,再用亲脂性有机溶剂提取即得总生物碱;对于水溶性生物碱也可直接用碱水液洗脱,得游离碱。如从钩吻根中提取具有良好抗癌作用的钩吻总生物碱,用0.3%硫酸水溶液浸泡1g钩吻根2次,每次2h,将滤液用NaOH调pH值至5.0,通过001×7强酸性阳离子交换树脂,用2mol/L的HCl洗脱生物碱,洗脱液用NaOH中和,调pH值至11.0,以氯仿萃取2次,浓缩萃取液至干,总收率为1.07%,纯度大于96%。大孔树脂吸附法也是一种很有效的纯化方法。如张红等人从喜树果中提取分离喜树碱,将喜树果粉碎,用80%乙醇于室温浸泡24h,过滤、回收乙醇,将水溶液的pH值调为8,用AB-8大孔树脂吸附,然后用等摩尔比氯仿/乙醇解吸。解吸液经过浓缩、干燥,再用等摩尔比氯仿/甲醇重结晶,可得纯度在90%以上的喜树碱。(2)溶剂及溶剂的萃取此法是利用亲脂性生物碱溶于亲脂性有机溶剂,而其盐溶于水的性质。即水或酸水提取液用碱液(常用的是氨水、石灰乳或石灰水等)碱化,使生物碱盐转变成游离碱,再用氯仿、乙醚或苯等亲脂性有机溶剂萃取,合并有机溶剂萃取液,浓缩即得总生物碱。对于醇类溶剂提取液,通常采取酸水一碱水—亲脂性溶剂的方法(或称氯仿提取法)反复进行。具体操作是将醇提取液减压回收溶剂,用稀酸水溶解,过滤除去不溶解的非碱性脂溶性杂质。未除净的脂溶性杂质,可用乙醚或氯仿萃取几次。酸水液碱化后用亲脂性有机溶剂如氯仿萃取,使生物碱盐转化为游离碱而溶于亲脂性有机溶剂与水溶性杂质分开。在碱化后用有机溶剂萃取操作中,也可在碱化前先加入有机溶剂,然后碱化,使刚游离出来的生物碱立即溶入有机溶剂,提取效率较高。另外还有混合溶媒沉淀法,如张学农等从骆驼蓬种子中提取生物碱,用80%乙醇热回流法得浸膏,将浸膏酸化后直接往酸液中加入氯仿/氨水(摩尔比为6:4)混合溶媒,立即有棕色沉淀析出,过滤,挥发去除氯仿得粗品。将混合溶媒沉淀法、氯仿提取法和阳离子交换树脂法相比较,结果是前两种提取法明显优于树脂法。3交叉萃取有助于生物提取3.1非极性溶剂超临界流体萃取(简称SFE)是近年来兴起的绿色化工分离高新技术。它的技术原理是一种溶剂对固体或液体的萃取能力在其超临界状态下较之在常温常压条件下可获得几十倍、甚至几百倍的提高。作为超临界流体的物质应用最多的超临界流体是CO2。但非极性的CO2只能有效萃取分子质量较低的非极性的亲脂性物质,且选择性不高。而生物碱往往具有一定的极性,且生物碱母体与生物碱以一定的化学方式相连,具有束缚作用,因此需适量加入适当的非极性或极性溶剂作夹带剂,并进行一定的前处理,以提高萃取能力。如用不同浓度乙醇为夹带剂提取可可碱,可使可可碱在CO2中的溶解度提高几十倍,且使萃取压力明显降低。又如在咖啡碱的提取中,纯超临界CO2几乎不能从干燥的咖啡豆中萃取出咖啡碱,而预先加入水,可减弱咖啡碱与咖啡母体间化学键的强度,使咖啡碱游离出来,溶于超临界CO2之中。目前比较常用的夹带剂有水、甲醇、丙酮、乙醇和乙酸乙酯等,其中甲醇和乙醇的使用最为广泛。超临界萃取技术与传统的化工分离技术,如水蒸气蒸馏法、溶剂萃取法等相比,有许多独特的优点。如兼备了精馏和液-液萃取的特点;操作参数易于控制;溶剂可循环使用,萃取速度快、效率高、能耗少;特别适合于分离热敏性物质,且能实现无溶剂残留。以上优点使超临界萃取技术用于天然产物提取成为研究热点。3.2超临界co提取其他氧化物超临界CO2萃取技术应用在生物碱提取中最早,最成功的例子是从咖啡豆中提取咖啡碱。工业上传统的二氯乙烷提取咖啡碱方法,会同时把芳香物质提取出来,残存的二氯乙烷也很难除净,从而影响咖啡质量。20世纪70年代,德国的Zosel博士将超临界CO2萃取工艺成功地应用于咖啡豆脱咖啡因的工业化生产。此后,欧美又有多项有关超临界萃取脱除咖啡豆中咖啡因的专利出现,使该工艺日趋完善并在欧美国家达到工业化生产规模,年加工咖啡豆1万～5万t,基本上取代了传统的有机溶剂萃取工艺,并且工艺流程不断完善。如将生咖啡豆先用一定量水浸渍,然后放在高压容器中通入约70～90℃和16～22MPa的CO2进行萃取,然后经水洗塔和蒸馏塔处理,咖啡豆中的咖啡碱可减小到0.02%以下,而芳香物没有损失;而Karz等人在工艺流程中加入反渗透装置,把技术、经济和环保问题结合在一起考虑,使之成为一个先进工艺,称之为MaxwellHouse咖啡脱咖啡碱工艺。我国学者还对从茶叶中提取咖啡碱做了一定研究。如汪小钢、萧伟祥用水作夹带剂,用超临界CO2提取茶叶中咖啡碱,再用CH2Cl2萃取分离,得到纯度为95.16%的咖啡碱,且与升华法、溶剂法等相比,可有效地分离咖啡碱和茶多酚。国内外学者也对用超临界CO2提取其他生物碱进行了一些研究。Janicat等人用超临界CO2加极性添加剂甲醇和水从罂粟茎中提取5种生物碱;如美国Schaeffer等人开发了从野百合植物中提取用于化疗的野百合碱的新技术;董超宇等人对烟草中的烟碱进行了超临界CO2萃取研究,寻找到萃取时间1.5～2h、萃取温度315～325K、萃取压力12～16MPa的最佳工艺条件,并且与有机溶剂提取相比,不会产生橡胶状物质,有利于进一步处理,对环境无污染;原永芳等人用乙醇为夹带剂从荜茇中提取胡椒碱,最佳萃取温度40℃,萃取压力26.1MPa,夹带剂为0.4ml乙醇,静态萃取时间15min,动态萃取体积5ml,与传统有机溶剂提取法相比较收率提高了7.3%,且操作简便快速,杂质