柴胡中主要成分含量测定方法的建立

柴胡中主要成分含量测定方法的建立

肝脏保护片能平肝理气，健脾消食。具有降低转氨酶作用。处方来源于《伤寒论》中小柴胡汤和茵陈蒿汤的配伍原理,结合现代药学研究及临床验证,使其组方更加合理。护肝片收载于《中华人民共和国药典》2010年第一版一部中,标准中仅载入了五味子和猪去氧胆酸的鉴别方法,文献中多见对护肝片中五味子、茵陈和猪胆粉的报道。柴胡是方中主要成分之一,为完善现有护肝片的质量标准,本文主要对柴胡中主要成分柴胡皂苷建立含量测定的方法。1材料表面1.1高效液相色谱法电子天平BT211D;可裁剪型薄层层析板;Goodsee-I薄层色谱摄影仪,CAMAGTLCSCANNER3,CAMAGLINOMAT半自动点样仪;水浴锅;电热鼓风干燥箱;离心机-AnkeTDL80-2B;平头微量进样器-10?L。1.2对二甲基氨基苯甲醛,三氯甲烷柴胡对照品a(中国生物制品检定所),柴胡对照品b2(中国生物制品检定所),甲醇,甲酸,正丁醇,氢氧化钠,氨水,浓硫酸,无水乙醇,石油醚,对二甲氨基苯甲醛,三氯甲烷。1.3试验样本各批护肝片的厂家及批号见(表1)。2方法和结果2.1展开剂的制备用刻度吸管分别吸取氯仿9mL、甲醇3mL、甲酸0.2mL,置于同一具塞锥形瓶中,振荡使充分混匀,即得展开剂。显色方法,2%对甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液,置于烘箱中60°C烘5min。扫描方法:以单波长λ=538nm吸收扫描,光束狭缝6.0mm×0.45mm,采用外标二点法,以积分峰面积同板测定柴胡皂苷a(d),b2(b1)的含量。2.2空白对照溶液的制备2.2.1供试品的制备取护肝片3片,研细,溶解于3mL的石油醚中,提取片刻,离心,除去上清液,至水浴锅中蒸干,残渣溶解于3mL的水中,每次加4mL的正丁醇,共提取三次。振摇片刻后离心,取上清液,加入4mL的氢氧化钠,反应片刻后离心,取上清液,加入氨试液4mL,离心,取上清液,加入蒸发皿中蒸干,残渣用适量甲醇溶解后转移至离心管中,定容至2mL。2.2.2空白对照溶液的制备按护肝片处方量的二十分之一备料,按如下方法制备成阴性空白样品。方中六味,绿豆粉碎成细粉;茵陈、板蓝根加水煎煮二次,每次2小时,滤过,滤液合并,静置24小时,取上清液于烘箱中加热干燥成干浸膏,用研钵研成细粉;五味子粉碎成粗粉,用适量75%乙醇超声提取2次,每次2小时,合并提取液,静置24小时,取上清液,回收乙醇并浓缩至适量,与绿豆细粉、猪胆粉、上面干燥所得的细粉及适量的辅料混匀,干燥得颗粒。自制样品未压片。取自制对照样品适量,按“供试品溶液的制备”的方法制备成溶液。2.3混合对照品溶液2.3.1柴胡皂苷对照品的制备分别精密称取经40°C、P2O5、真空干燥处理12小时的柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2各6～7mg,置同一10mL容量瓶中,并加甲醇定容至刻度,摇匀,即得每mL含柴胡皂苷a、b2各0.6～0.7mg的混合对照品溶液。2.3.2柴胡对照药材溶液的制备取柴胡药材粗粉适量,加入甲醇超声提取30min,离心后取上清液,即得到柴胡对照药材(直接提取)的溶液(0.1g/mL)。柴胡对照药材溶液(煎煮)按供试品方法提取(0.1g/mL).2.4药材提取物、成分配液护肝片供试品点样6μL,空白对照溶液5μL,柴胡皂苷a、b混合溶液3μL、柴胡对照药材溶液(煎煮)5μL、柴胡对照药材溶液(直接提取)5μL,点在一块薄层板上。图1(Ⅰ、Ⅱ)中点1为供试品溶液,点2为阴性样品溶液,点3为柴胡皂苷a、b2混合对照品溶液,点4为柴胡对照药材溶液(煎煮),点5为柴胡对照药材溶液(直接提取)。2.5柴胡皂苷a标准曲线的绘制分别精密吸取“2.2.1”项下溶液2、4、6、8、10μL点于同一薄层板上,每量2点,依量循环点样,展开,显色,扫描,以各点每量吸收值均数为纵座标,点样量为横座标绘制标准曲线,得柴胡皂苷a的线性回归方程:Y=2.23X×103+5.2×102(r=0.996,线性范围1.30～6.50μg)。柴胡皂苷b2的线性回归方程:Y=2.80X×103+7.7×102(r=0.999,线性范围1.32～6.61μg)。2.6确定柴胡皂苷b的r.s.d同板精密度:取上述所制的供试品溶液,共点6个点,每个点样5?L,展开,显色后,根据扫描所得峰面积的数值计算R.S.D。计算可得其柴胡皂苷a的R.S.D为3.77%,柴胡皂苷b的R.S.D为2.05%。异板精密度:取上述所制得供试品溶液,点在6块板上,每个板点3个点,每个点样5?L,展开,显色后,根据扫描所得峰面积的数值计算R.S.D。计算可得其柴胡皂苷a的R.S.D为3.83%,其柴胡皂苷b的R.S.D为2.87%。2.7供试品溶液的稳定性溶液稳定性:取上述所制得的供试品溶液,取时间0h,1h,2h,3h,4h,5h,各点样5?L,共点3个点,展开,显色后,根据扫描所得柴胡苷a的RSD为3.24%,柴胡皂苷b2的R.S.D为2.29%,均小于5%。薄层显色稳定性:取上述制得的供试品溶液,点3个点,每个5?l,展开,显色后,在时间0min,10min,20min,30min,40min,50min,60min对皂苷斑点进行扫描测定,根据扫描计算所得RSD为柴胡皂苷a的RSD为2.34%,柴胡皂苷b2的RSD为2.02%。由上述可得结论可知,护肝片供试品溶液在6小时内较为稳定,薄层显色后在1小时内测定结果,误差在允许范围内。在薄层显色稳定性的实验中,柴胡皂苷的峰面积变化较小,薄层板对显色后的结果影响较小。2.8样4:5?l取上述所制得的6个供试品,分别点在6块板上,每个板上点三个点,每个点样5?L,展开,显色后,扫描。根据实验所得峰面积计算可得其柴胡皂苷a的RSD为4.56%,柴胡皂苷b的R.S.D为4.49%,变异系数均在5%的范围内,故在相同条件下,重复该次实验所得的柴胡皂苷的结果变化较小。2.9供试品溶液的制备取6份已知含量的护肝片,加入适量的柴胡皂苷对照品溶液,按照重复性实验的溶液提取制备步骤,制得供试品。实验常用该方法用来评价测定结果与真实值或参考值接近的程度。结果见表2。2.10试验结果见表2按表1中的5种护肝片试药,每种护肝片取5片,按重复性实验的方法制得5个供试品。用外标二点法,分别精密吸取供试品溶液5?L及对照品溶液2?L,10?L,交叉点于同一薄层板上,各点2点。如法展开、显色、扫描,按峰面积计算供试品中各柴胡皂苷的含量。每份供试品溶液另做平行试验1次,即每一供试品重复测定2次。所得结果见(表3)。以上数据表明,江西汇仁药业有限公司所生产的护肝片质量较好,且不同批号之间的护肝片的质量稳定。修正药业和哈药制药集团六厂所生产的护肝片的质量稍差,其中柴胡皂苷a的含量较少,可能是在柴胡煎煮过程中,柴胡皂苷a大部分都转化为柴胡皂苷b的缘故。山西云鹏制药有限公司所生产的护肝片质量很差,几乎检测不出柴胡皂苷的量。3更有利于确定柴胡皂苷的含量进行鉴别和分析后,发现有多家生产的护肝片质量参差不齐,在对护肝片进行柴胡皂苷的含量测定后发现几家生产的护肝片质量差异较大。通过对护肝片中柴胡皂苷的鉴定和评价,可以得到采用薄层对柴胡皂苷定性比高效液相色谱分析更具有科学性,合理性。用HPLC法测定复方制剂中柴胡皂苷的含量时,由于柴胡皂苷a(d)仅有末端吸收,且干扰成分与柴胡皂苷很难达到基线分离,影响测定结果的准确性。同时对柴胡皂苷分析中,通过回收率、重复性、精密度和稳定性