hplc法同时测定护肝片中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的含量

hplc法同时测定护肝片中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的含量

肝保护片由柴胡和五味子组成。从1995年到2010年，中国的药店都记录了这一功能，具有平肝理气、健脾消食、活血化瘀、减少转氨酶等作用。现代药理研究证实方中五味子所含五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素等多种木脂素类化合物是其降低转氨酶的主要有效成分,尤以五味子乙素最明显。2010年版中国药典和文献报道对护肝片中五味子的质量控制多是选取1种或2种指标性成分,目前尚未有同时测定护肝片中五味子3种木脂素成分的报道。本文以五味子中含量较高的五味子醇甲和护肝作用最强的五味子乙素作指标,确定了提取方法,建立了HPLC同时测定护肝片中3种木脂素成分含量的方法,以期为控制护肝片中五味子的质量提供参考依据。1对照品和试剂Angilent1200型高效液相色谱仪,ShimadzuLC-10A可见紫外分光光度计,Precisa92SM-202DA电子天平,AS5150A超声波清洗器。五味子醇甲(110857、200709)、五味子甲素(110764、200408)、五味子乙素(110765-200508)对照品均购自中国药品生物制品检定所;甲醇、乙腈为天津市科密欧化学试剂有限公司,色谱纯;其他试剂均为分析纯;水为娃哈哈纯净水。柴胡、茵陈、板蓝根、绿豆、南五味子和北五味子、猪胆粉均购自信阳市药品公司,经本所潘永峰副主任中药师鉴定为正品。3个厂家的护肝片均为市售:公司A批号为100606,公司B批号为20100808083,公司C批号为100804。2柱温度和温度AngilentEclipseXDB-C18色谱柱(150mm×4.6mm,5μm),流动相甲醇-水梯度洗脱,其中甲醇浓度(V/V)60%(0～8.00min);60%→74%(8.01～10.00min);74%(10.01min～30.00min);74%→60%(30.01～31.00min);检测波长250nm,柱温25℃,流速1.0mL·min-1,进样量10μL。取批号为100606的样品,比较正己烷索氏提取6h、甲醇超声提取(30min、60min)、甲醇回流提取(30min、60min)、乙酸乙酯超声提取(30min、60min)、乙酸乙酯回流提取(30min、60min)等不同溶剂系统的提取效率,结果甲醇回流30min提取时五味子醇甲和五味子乙素的含量均最高,干扰峰较少且分离较好,故选甲醇回流30min作为样品的制备方法。2.3方法的回收率2.3.1对照品溶液制备:精密称取10.95mg五味子醇甲、7.75mg五味子甲素、7.35mg五味子乙素对照品,用甲醇作溶剂分别溶解于25mL量瓶中,再分别精密量取2mL置10mL量瓶中,用甲醇定容,得3种成分分别为87.60、62.00、58.80μg·mL-1的溶液,供分析进样和加标回收用。2.3.2样品溶液制备:取本品10片,除去包衣,精密称定,研细,取0.7g,精密称定,加甲醇25mL加热回流30min,放冷,滤过,用甲醇30mL分次洗涤滤渣及容器,洗液与滤液合并,回收至小体积,转移至25mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得。2.3.3阴性样品溶液制备:根据2010年版药典的护肝片处方,制备不含五味子药材的阴性样品,按上述方法操作,即得。2.4线性范围和精密度2.4.1系统适用性实验:分别吸取对照品混合溶液、批号为100606的供试品溶液、阴性样品溶液,自动进样10μL,记录色谱图(见图1)。3种木脂素峰能完全分离,阴性样品不干扰测定。2.4.2线性关系考察:精密吸取对照品混合溶液1、5、10、15、20μL,自动进样,以峰面积积分值对进样量(μg)进行回归处理,得五味子醇甲、甲素和乙素3种木脂素的标准曲线分别为y=876.79x-1648r=0.9993,y=603.95x-1132.8r=0.9993,y=518.37x-971.15r=0.9992;线性范围分别为0.088～1.752,0.062～1.240,0.059～1.176μg。结果表明,每种木脂素成分在其线性范围内均有良好的线性关系。2.4.3精密度实验:精密吸取对照品混合溶液10μL,重复进样6次,记录峰面积。结果3种木脂素峰面积的RSD分别为0.5%、0.3%、0.6%,表明本方法精密度良好。2.4.4稳定性实验:取批号为100606的样品溶液,分别于0、1、3、6、9、12h进样10μL,记录峰面积。计算3种木脂素峰面积的RSD分别为1.1%、0.7%、1.2%,表明供试品溶液在12h内基本稳定。2.4.5重复性实验:取批号为100606的样品,按“2.3.2”项下相应的方法制备5份供试品溶液,分别进行测定。计算3种木脂素含量的RSD分别为1.3%、2.1%、1.7%,表明供试品溶液重复性良好。2.4.6加样回收率实验:精密称取已知含量的批号为100606的样品约0.7g,再精密加入对照品混合溶液5mL,按“2.3.2”项方法平行制备5份样品溶液(各组分在样品中的加入量为:五味子醇甲262.8μg,五味子甲素186.0μg,五味子乙素176.4μg)按“2.1”项下方法测定,记录色谱图,计算3种木脂素平均回收率为100.6%、101.2%、99.6%,RSD(n=5)分别为1.3%、1.7%、1.1%。2.4.7样品测定结果:按照“2.3.2”项下相应的处理方法,分别称取3个批号样品制备供试品溶液,分别进样10μL,测定峰面积,代入线性回归方程,计算每片样品中五味子醇甲、甲素和乙素的平均含量(见表1)。3讨论3.1药中药代动力学及药化学成分的含量文献研究表明,五味子的近似种和混淆品较多,木脂素类成分在不同五味子属药材中的类型及其含量有显著差别,并且他们的含量并不严格呈正相关,药材中五味子醇甲含量高不一定五味子乙素或五味子甲素的含量也高。同时测定护肝片中五味子醇甲、甲素和乙素3种成分较测一种成分能更好地判定其中五味子药材质量的优劣,并提高方法的专属性。3.2药代动力学测定波长的确定试验中分别取一定浓度的3种木脂素对照品的甲醇溶液,于紫外区全波长扫描,在液相色谱仪上测定不同波长处对照品和同一浓度样品的峰面积,结果表明五味子甲素和五味子乙素250nm处的吸收度、峰面积均比254nm处的高,五味子乙素的护肝作用又最强,故选250nm作测定波长。3.3色谱条件选择实验研究了不同比例的甲醇-水系统,发现最后出峰的五味子乙素保留时间随甲醇比例的变化有大幅的改变(甲醇体积改变2%变化5～10min),欲使3种木