抗乳腺癌单链抗体的制备及应用

抗乳腺癌单链抗体的制备及应用

放射性核素标记单克隆抗体在放射免疫显微病象（ri）中的诊断，尤其是复发癌和转移瘤的早期发现方面发挥了独特作用，但临床应用中遇到的问题之一是血液水平高，靶器官与周围组织（t.b）的比例较低，这会影响图像的质量。这主要是由于单克隆抗体分子较大（150KD），进入人体代谢速度较慢的缘故。为此本文研制了与乳腺癌特异结合的单链抗体，并在乳腺癌细胞系和荷人乳腺癌裸鼠中进行了放射免疫显像（RII）的初步研究，现报道如下。1材料和方法1.1研磨法纯化lc-膜产物取我院经病理确诊的乳腺癌患者手术切除新鲜肿瘤组织，在提取液（lmmol/LPMSF,0.1mol/LPBS,0.5%Triton,0.15mol/LNaCl）中研磨超声粉碎（功率350W，强度60%）累计20分钟，分级离心（2000g20分钟，5000g20分钟，20000g60分钟），得到TCL-膜抗原及可溶性抗原的混合物。1.2elisa及免疫组化方法Balb/C小鼠分别在当天、第14天及第21天用抗原免疫，前两次腹腔免疫，最后一次尾静脉免疫，3天后取免疫过的小鼠脾细胞与Ns-1小鼠骨髓瘤细胞融合，利用ELISA及免疫组化方法进行筛选，选取阳性孔进行再克隆，筛选出特异性好的一株M4G3。1.3scfv抗体的构建取M4G3杂交瘤细胞5×106，提取RNA，经Oligo(dT）柱得mRNA，随机引物逆转录制备cDNA，利用鼠IgV基因框架上重、轻链可变区基因两对高保守引物，分别扩增重、轻链基因片断（340bp,325bp），再经一联接序列组成单链可变区片断（ScFv)(Pharmcia噬菌体抗体制备试剂），经改造粘性末端后重组至PCANTAB5E噬菌粒中，转化大肠杆菌，辅助噬菌体K07感染，得表面表达抗体噬菌体，经抗原直接筛选得阳性重组噬菌体，经再感染，再筛选后，感染EcoliTG1和HB2151得到可溶性具有抗乳腺癌活性的ScFv抗体，ELISA显示与乳腺癌膜抗原有较强的亲和力。1.4抗虫试验纯化后的ScFv抗体的放射性核素标记采用环DTPA法。1.5透析袋内、外液的cpm标记率采用蛋白透析方法，将标记好的ScFv-DTPA-99mTc4+放入透析袋内，透析外液为PBS800ml，放入4℃冰箱内透析过夜，利用γ-计数器（美国Centocor产品）分别测量透析袋内、外液的cpm值，为cpm1和cpm2，按下例公式计算其标记率R:R=cpm1/(cpm1+cpm2）×100%。1.6肿瘤移植Balb/C裸鼠5周龄，体重约17g。颈部皮下接种人MCF-7细胞系107细胞，20天后可见颈部形成一约0.8cm的肿瘤。1.7实验组和细胞组织乳腺癌细胞系MCF-7置于24孔板内，在CO2孵育箱中培养2天，镜下可见到细胞形态良好，呈贴壁生长。实验分2组：实验组、阴性对照组，每组各有三组平行实验。实验组：将24孔板中培养基弃掉，加入标记单链抗体0.2mCi/10μg（缓冲液PBSpH=7.4),37℃孵育1小时后弃去，生理盐水洗3遍，γ照相机显像。将标记单链抗体换为生理盐水，重复上述步骤即为阴性对照组。1.8scfv-dtpa检测用SophAγ相机，预置能峰140kev（窗宽20%），针孔准直器采集平片。移植裸鼠腹腔注射ScFv-DTPA0.lmg/2ml，并在注射后1、3、5天显像，显像当天注射2mCi99mTc4+。第5天显像后处死小鼠，分离各脏器及肿瘤组织，称重并测其cpm。2结果2.1gs-ms3：对乳腺癌的耐药性免疫过氧化物酶染色显示M4G3对人乳腺癌组织结合的敏感性与其他恶性肿瘤（2/24）和良性肿瘤（0/7）相比较，M4G3对乳腺癌具有很高的敏感性（23/24）。2.2标记抗剂标记抗体为无菌、无热源、无毒性，其体外标记方法简单，同时具有很高的标记率，见表1。2.3外生殖器细胞成像结果显示，实验组可见标记单链抗体与培养肿瘤细胞结合影像，而阴性对照组则出现阴性结果，表现为中空的环状影像，见图1。2.4血中放射性的变化注射标记抗体5天后，肿瘤组织的放射性较正常组织高。在正常组织，血池及网状内皮组织（如肝脾）也有较高的放射性。注射后第1天，接种MCF-7裸鼠血中放射性很高。肝脏是主要的摄取大量放射性的非肿瘤脏器。第3天血中的放射性很低，即使不减除本底也可使肿瘤显像，并可持续到第5天，见图2。5天显像完毕后，解剖小鼠计数各脏器的cpm值，结果除了肝、肾外，其余脏器的γ计数均远远低于肿瘤组织，见图3。3第三代scfv抗体单克隆抗体具有高特异、高结合力等诸多优良品质，为导向诊断、导向治疗的“魔弹”，但由于鼠源的免疫原性及分子量较大的特性，限制了其在人体内应用。随着免疫球蛋白（Ig）分子基因学的阐明，分子生物学技术的迅速发展，使用基因工程方法改造、制备抗体的技术、方法日渐成熟。20世纪90年代，特别是抗体库技术的问世，为抗体制备开辟了全新的技术领域。近些年来，将优良的鼠源单克隆抗体进行改造，取得了突破性的进展。基因工程抗体———第三代抗体包括：单链抗体（ScFv）、鼠/人嵌合抗体（chimericAb）、人源化抗体（HumannizedAb）、小分子抗体（CDR区）。ScFv抗体具有易于穿透组织细胞，较少异源性的优点，保留了完整抗体能与抗原特异结合的特性，同时分子较小（30KD），因此，在体内与肿瘤结合速度较快，而且未与肿瘤结合的单链抗体从体内清除的速度很快，有利于放射免疫显像（及治疗）的应用。我院自行研制的抗乳腺癌单克隆抗体M4G3特异性好，已常规用于病理的鉴别诊断，在此基础上，我们成功克隆表达了ScFv抗体。不同人肿瘤组织和良性病变组织的免疫组织化学分析显示，M4G3的ScFv特异性定位