超氧化物歧化酶的应用

超氧化物歧化酶的应用

1938年，曼宁和魁21首次从牛红细胞中分离了蓝色铜氨酸。1969年，mc打破和发现该蛋白具有诱导o2和偏离反应的功能，并将该酶称为超级氧化物变化酶（sod，ec1.15.1）。该酶是体内一种重要的氧自由基清除剂,能够平衡机体的氧自由基,从而避免当体内超氧阴离子自由基浓度过高时引起的不良反应,同时SOD是一种很有用途的药用酶。有关SOD的研究受到国内外学者的广泛关注,涉及到化学、生物、医药、日用化工、食品诸领域,是一个热门研究课题。通过多年努力,在SOD的基础研究方面取得了巨大成果。目前,SOD临床应用主要集中在抗炎症方面(以类风湿以及放射治疗后引起的炎症病人为主),此外对某些自身免疫性疾病(如红斑狼疮、皮肌炎)、肺气肿、抗癌和氧中毒等都有一定疗效;在食品工业主要用作食品添加剂和重要的功能性基料;在其它方面也有相关应用。现就有关SOD的基础研究进展及应用方面作以简述。1sod的分类SOD是一类清除自由基的蛋白酶,对需氧生物的生存起着重要的作用,是生物体防御氧毒性的关键。迄今为止,科学家已从细菌、真菌、原生动物、藻类、昆虫、鱼类、植物和哺乳动物等生物体内都分离得到了SOD。基于金属辅基不同,这些SOD至少可以分为Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD三种类型。一般来说,Fe-SOD是被认为存在于较原始的生物类群中的一种SOD类型;Mn-SOD是在Fe-SOD基础上进化而来的一种蛋白类型,由于任何来源的Mn-SOD和Fe-SOD的一级结构同源性都很高,均不同于Cu/Zn-SOD的序列,可见它们来自同一个祖先;Cu/Zn-SOD分布最广,是一种真核生物酶,广泛存在于动物的血、肝和菠菜叶、刺梨等生物体中。除以上三种SOD外,Sa-OukKang等人最近又从链霉菌Streptomycesspp.和S.coelicotor中发现了两种新的SOD,一种是含镍酶即Ni-SOD,另一种是含铁和锌的酶即Fe/ZnSOD,它们均为四聚体,表观分子量分别是13KD和22KD,它们之间没有免疫交叉反应。2氧氢酶反应中的o32-和o2超氧化物歧化酶作用的底物是超氧阴离子自由基(O⋅−22⋅-),它既带一个负电荷,又只有一个未成对的电子。在不同条件下,O⋅−22⋅-既可作还原剂变成O2,又可作氧化剂变成H2O2,H2O2又在过氧氢酶(Catalase,CAT)的作用下,生成H2O和O2,由此可见,有毒性的O⋅−22⋅-在H2O2又在过氧氢酶(Catalase,CAT)的作用下,生成H2O和O2,由此可见,有毒性的O⋅−22⋅-在SOD和CAT共同作用下,变成了无毒的H2O和O2。其作用机理如下:SOD+O⋅−2→SOD−+O2SΟD+Ο2⋅-→SΟD-+Ο2SOD−+O⋅−2−→−+2H+SOD+H2O22O⋅−2+2H+−→−SODO2+H2O2H2O2−→−CATH2O+O2SΟD-+Ο2⋅-→+2Η+SΟD+Η2Ο22Ο2⋅-+2Η+→SΟDΟ2+Η2Ο2Η2Ο2→CAΤΗ2Ο+Ο23sod的结构和性能3.1cuzn-sod的结构超氧化物歧化酶(SOD)从结构上可分为两族:CuZn-SOD为第一族,Mn-SOD和Fe-SOD为第二族。天然存在的SOD,虽然活性中心离子不同,但催化活性部位却具有高度的结构同一性和进化的保守性,即活性中心金属离子都是与3或4个组氨酸(His)、咪唑基(Mn-SOD含1个天门冬氨酸羧基配位)和1个H2O分子呈畸变的四方锥或扭曲的四面体配位。CuZn-SOD作为SOD结构上的第一族,是人们对于SOD结构研究的突破口,也是人们了解最多的一种SOD。比较不同来源的CuZn-SOD的氨基酸序列可以发现,它们的同源性都很高。有些氨基酸还很保守,在所有序列中都不变,这暗示着这些氨基酸与活性中心有关。如图1牛红细胞CuZn-SOD的结构所示:每个铜原子除分别与4个组氨基酸残基(His44.46.61.118)的咪唑氮配位外,还与一轴向水分子形成远距离的第五配位,Zn则与3个组氨酸残基(His61.69.78)和1个天冬氨酸(D81)配位。Cu、Zn共同连接组氨酸61组成“咪唑桥”结构。Mn-SOD和Fe-SOD同属于SOD结构上的第二族,Mn-SOD是由203个氨基酸残基构成的四聚体,Mn(Ⅲ)是处于三角双锥配位环境中,其中一轴向配位为水分子,另一轴向被蛋白质辅基的配位His-28占据,另3个配基His-83、His-170和Asp-166位于赤道平面。Fe-SOD的活性中心是由3个His,1个Asp和1个H2O扭曲四面体配位而成。3.2主要的理化性质SOD是一种酸性蛋白,在酶分子上共价连接金属辅基,因此它对热、pH以及某些理化性质表现出异常的稳定性,其主要的理化性质见表2。从上面可以看出,Mn-SOD、Fe-SOD的结构特征是不含半光氨酸,含有较多的色氨酸和酪氨酸,因此紫外吸收光谱类似一般蛋白质,在280nm附近有最大吸收峰,Mn-SOD的可见光谱在475nm处附近有最大吸收,Fe-SOD在350nm处有最大吸收,这都反映了所含金属离子的光学性质。4生物酶提取与纯化sod发酵工艺目前国内已开发的SOD产品绝大分都是Cu/Zn-SOD,它们最早是从动物的血、肝中分离提取的,主要有以下几个步骤:溶血液的制备、选择性热变性、超滤浓缩、丙酮沉淀、柱层析、冷冻干燥。但是由于这种方法不可避免地发生一些交叉感染,过敏性反应等现象,开发研究从植物中提取SOD就显得尤为重要。我国近年来在植物SOD的研究领域有大量相关报道。许平、袁艺、赵文芝、余旭亚等分别从大蒜、桑叶、沙棘、仙人掌中提取SOD并进行了相关研究。其提取方法主要有分步盐析法、有机溶剂沉淀法、层析柱法等。除了从动植物中提取SOD外,选育SOD高产菌株进行发酵生产也是比较有价值的一种方法。1997年王岁楼等人自然筛选出1株SOD高产菌株Y-216,酶活可达600U/g湿菌体,并对其形成SOD的生理条件作了初步研究,为SOD的工业化发酵生产打下了基础。吴思芳等人研究了从啤酒废酵母生产、提取、纯化SOD的方法和条件,得到比活为3048U/mg的SOD酶,指出开展啤酒废酵母生产SOD的综合利用具有经济价值和社会意义。由于天然SOD来源有限,且具有异体蛋白免疫原性,外源SOD不易被人体接受等缺陷,使之在应用方面受到很大限制。SOD基因工程是广开酶源,降低成本和获得无抗原性的人源SOD的有效途径。近年来,美、日、英、德相继开发了微生物SOD基因工程产品,并进行了临床实验。我国医学科学院基础医学研究所和海军总医院分子生物学研究室已成功将人血CuZn-SOD克隆到大肠杆菌中,表达率高达50%。施惠娟等分别以人胎肝组织及人肝细胞株(L02)总RNA为模板,以RT-PCR法获得hCuZn-SOD和hMn-SODcDNA,构建表达质粒pETSOD,并导入E.coli细胞中使之表达。分别获得了38%和50%的高表达率,且表达的SOD有酶活性。鉴于重组的人SOD在体内半衰期仍很短,施惠娟等又通过基因工程的方法将rhCuZn-SODcDNA基因改造得到了更加稳定的酶。以上说明了我国人源SOD在微生物细胞中的克隆和表达已达到了国际水平。目前,国内外在基因工程生产SOD方面均取得了可喜的成果。5小分子模拟化合物与天然SOD相比,SOD的模拟物有着更显著的优点。首先是获取和制备比天然SOD要简单得多。天然SOD要从人或其它生物中提取,这就决定了天然SOD的提取必然困难重重,而且产量不高。而模拟SOD可以用化学方法来人工合成,其物质和能量消耗低,且产量不会受到限制。其次,天然SOD作为一种生物大分子,在进入体内时存在着诸如进入细胞能力弱、细胞渗透性差、在血中半衰期短(在人体中SOD只是在很短时间内稳定,其半衰期为分钟级)、不能口服、价格昂贵等缺点。另外,对于非人体SOD还存在着造成免疫损伤的可能。所以人们把目光投向了SOD模拟物,尤其是低分子量模拟物上。目前,生物无机化学家们合成和表征了一系列含铜、锰、铁等金属离子的小分子配合物来模拟SOD,期待将来能用小分子模拟化合物代替SOD应用于临床。其中研究最多的含铜络合物是3,5-二异丙基水杨酸铜[Cu(3,5-DIPS)],这是一种低分子量的亲脂性络合物,具有天然CuZn-SOD样活性,可以起到抗炎及减轻由链脲菌素诱导产生的糖尿病。刘京萍等合成的铁(Ⅱ)-酪氨酸模拟SOD金属酶,分子量比天然酶小得多,与天然SOD活性差距较小,且毒性小,从而大大推进了人工合成具有分子质量较小、稳定性高、毒性较底、活性较高等优点的SOD模拟物的研究工作。但是由于超氧化物歧化酶的模拟属于新型交叉学科,需要化学和生物学知识乃至技术的高度结合,目前的模拟还没有走向成熟,相信随着21世纪化学生物学的崛起,这一新兴交叉学科将会对化学、生物学及医学产生深远的影响。6sod的使用6.1利用天然食品作为食品的应用与其它抗氧化剂一样,SOD可作为罐头食品、果汁、啤酒等的抗氧化剂,防止过氧化酶引起的食品变质及腐败现象;还可作为水果、蔬菜等的良好保鲜剂。由于绝大部分蔬菜、水果都含SOD,其中含量较高的有:刺梨、香蕉、猕猴桃、菠萝、山楂、大蒜等,水果果皮中SOD活性明显高于果肉,且水果SOD活性在储藏期内均呈下降趋势。人们就充分利用这些富含SOD的原料开发天然保健食品如芦荟汁、大蒜素、刺梨汁、菠萝汁、麦绿素等。其中麦绿素是以大麦嫩叶为原料经浓缩提取的。其它含SOD的食品有:食用菌、扇贝、鸡、调味品等。常见食用菌中猴头菇SOD活性较强,达3120U/g湿菌丝。灵芝菌活性也很高,已被制成灵芝酒投放市场。常见调味品中,发现酱油、鱼露、豆腐乳中均含SOD样活性物质,其具体性质还有待进一步研究。另外还可以作为营养强化剂加入食品中制成新的保健食品,例如绿茶饮料有预防龋齿、敏感症、痛风、降压、抑制氧化等作用;番木瓜SOD酒采用低温生物技术发酵而成,是一种低度纯天然的绿色健康型果露酒,能帮助消化,消除慢性胃炎,舒张血管,降低血压等作用。目前已开发的还有蛋黄酱、酸牛奶、可溶性咖啡、奶糖等产品。为扩大SOD在食品中的应用范围,需增强SOD的稳定性,有必要对SOD进行化学修饰,选择无毒副作用的物质作为修饰剂,例如肝素化合物、硫酸软骨素、脂肪酸等,其中由玻璃酸、月桂酸修饰的SOD已投入商品化生产。有研究表明,制成SOD脂质体不仅能增强稳定性,还能促进人体皮肤的吸收。6.2治疗生物免疫生化疾病正常生命过程中产生的超氧阴离子自由基是维持生命所必需的,当其浓度过高时,对机体会造成损害。因此超氧化物歧化酶作为其特异清除剂,在生物体的生命活动中具有重要意义。大量研究表明,SOD活性低下可以看作是某些疾病的特征之一。SOD是O⋅−22⋅-的“克星”,具有抗炎、抗病毒、抗辐射、抗衰老等作用。在病毒性疾病、自身免疫性疾病、心肌缺血和缺血再灌流综合症、老年性白内障、心血管疾病、辐射病、癌和癌的放射治疗预防以及人类长寿等领域的研究中也己有突破性进展。目前,SOD作为药用酶已经开始试用于治疗关节炎、红斑狼疮等疾病。6.3预防口腔疾病SOD既可以作为药用酶,也可作为化妆品的添加剂,国际生化委员会,美国联邦食品管理局称其为“抗衰因子”、“美容娇子”。具有抗衰老、防晒、抗炎等功效。SOD还可以加入到牙膏、漱口水、含片等中,对预防口