标准贮备菌株鉴定操作规程

文献类别质量管理生效日期01月31日复评日期01月30日文献名称原则储藏菌株鉴定操作规程颁发部门质量部1主题内容与合用范畴本规程规定了原则储藏菌株鉴定的操作办法。本规程合用于对原则储藏菌株的鉴定。2引用原则《药品生产质量管理规范》、《中国药典》及《伯杰氏系统细菌学手册》现行版3职责微生物检测质检员：负责按本规程对微生物原则菌株进行鉴定。质量部负责人：负责按本规程对原则菌株的鉴定成果进行审核。质量部QA：负责监督本规程的执行；4程序采购的原则菌株需进行纯度和特性确实认。4.1办法增菌培养→分离培养→纯培养→确认实验（菌落形态、革兰氏染色、镜检、生化鉴定）4.1.1纯培养用无菌接种环挑取待鉴定菌落/菌液至对应的琼脂培养基斜面或平板上培养，得到纯化的单一菌落，做下列检查。4.1.2革兰氏染色、镜检4.1.2.1革兰氏染色原理（1）革兰氏染色法可将全部细菌分为两大类：革兰氏阳性细菌G+和革兰氏阴性细菌G－。细菌对于革兰氏染色的不同反映是由于它们细胞壁的成分和构造不同而造成的。（2）革兰氏阳性细菌G+：其细胞壁重要是由肽聚糖形成的网状构造构成的，在染色过程中，当用结晶紫溶液染色细胞后用脱色剂脱色时，引发细胞壁肽聚糖糖层网状构造中的孔径缩小以至关闭，通透性减少，使结晶紫－碘复合物被保存在细胞内而不易脱色，因此呈现深紫色。（3）革兰氏阴性细菌G－：其细胞壁中肽聚糖含量低而脂类物质含量高，当用乙醇脱色时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫－碘复合物易被乙醇抽出而脱色，继而又被复染液着色，因此呈现红色。4.1.2.2革兰氏染色液(1)草酸铵结晶紫溶液：结晶紫乙醇饱和液(结晶紫2g溶于20ml95%乙醇中)20mlL，1%草酸铵水溶液80ml将两液混匀置24h后过滤即成。

(2)卢戈氏碘液：碘0.33g，碘化钾0.66g，蒸馏水100ml。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，然后加入碘使之完全溶解，再加蒸馏水至100ml即成。配成后贮于棕色瓶内备用，如变为黄色即不能使用。

(3)95%乙醇：用于脱色，脱色后可选用下列(4)复染即可。

(4)番红溶液：番红O2.5g，95%乙醇100ml，溶解后可贮存于密闭的棕色瓶中，用时取20ml与80ml蒸馏水混匀即可。4.1.2.3染色过程（1）在干净载玻片上滴上一滴灭菌纯化水，用无菌接种环挑取一菌落均匀涂开，制成均匀涂片，涂布不适宜太厚或太薄，以免影响染色效果。（2）将上述涂片自然风干或在酒精灯火焰上方快速来回2～3次微热使之干燥、固定。以玻片背面接触手背不烫为准，否则可能使细菌形态变化，影响观察成果。（3）涂片冷却后，滴加1～2滴结晶紫溶液，保存约1分钟，用冷水快速冲掉载玻片表面多出结晶紫溶液。（4）滴加1～2滴碘液，媒染约1分钟，水洗，以滤纸吸干水分。（5）滴加95%乙醇，脱色20~30秒，至流出液无色(无紫色脱落为止)，立刻用冷水快速冲净脱色酒精。（6）甩去多出水滴，滴加沙黄染液，复染约1分钟后用冷水冲去沙黄染液，用滤纸吸干载玻片背部水份，将载玻片置空气中晾干。（复染的时间不能太长，否则很容易将阳性菌染成阴性菌，且如果超出10秒复染液将干涸，影响镜检）（7）成果阐明：菌体呈紫色或蓝紫色为革兰氏阳性菌(G+)；菌体呈红色，即为革兰氏阴性菌(G－）。4.1.2.4镜检在载玻片的菌膜上滴一滴香柏油，用显微镜的油镜观察标本。菌体呈红色为革兰氏阴性菌G-，菌体呈蓝紫色为革兰氏阳性菌G+。同时观察菌体的状态、排列，分辩并描述是球菌、杆菌、弧菌、放线菌以及菌体大小。4.2菌株鉴定办法4.2.1铜绿假单胞菌4.2.1.1纯培养用接种环沾取菌落/菌液于胰酪大豆胨琼脂斜面或胰酪大豆胨琼脂培养基平板上划线，置于30～35℃培养箱中培养18~24小时后，做下列检查。4.2.1.2形态学鉴定4.2.1.2.1菌落形态：菌体扁平、呈灰白色、无定形、边沿不齐周边扩散，表面湿润，周边有蓝绿色素。4.2.1.2.2革兰氏染色及镜检革兰氏染色（见4.1.2.3）、镜检（4.1.2.4）革兰氏染色鉴定成果：菌体呈红色，革兰氏阴性菌（G－）。镜检鉴定成果：革兰氏阴性杆菌，为短链状的排列。4.2.1.3生化特性鉴定4.2.1.3.1触酶实验（1）试剂：3%过氧化氢溶液（2）办法与成果：使用接种环大量挑取TSA平板上的新鲜菌苔至3%过氧化氢溶液安剖管中，观察成果。立刻产生大量气泡为阳性，否则为阴性。4.2.1.3.2氧化酶实验用镊子夹住氧化酶试纸片，使用无菌吸管吸取纯水滴加至纸片1～2滴使湿润，用镊子夹着纸片在新鲜平板上蘸取大量新鲜菌苔，1分钟内观察成果。该实验应在划线TSA平板后的次日立刻操作，确保使用的是新鲜菌苔。试纸变成蓝色为阳性，否则为阴性。4.2.1.3.3绿脓菌素（Pyoeyanin）实验（1）培养基：绿脓菌素测定琼脂斜面PDP（2）办法与成果：使用接种环挑取TSA平板上的新鲜菌苔划线接种于绿脓菌素测定琼脂斜面，30～35℃培养箱中培养24小时。培养结束后菌苔呈绿色或蓝绿色为阳性，否则为阴性。4.2.1.3.4明胶液化实验（1）培养基：明胶生化管（2）试剂：比浊管，生理盐水（3）办法与成果：使用接种环挑取TSA平板上的新鲜菌苔至生理盐水中，使菌液浊度与比浊管相似（比浊管使用前应充足震荡混匀），制成菌悬液。用无菌吸管，于明胶生化管中滴加1～2滴上述菌液，加塞，30～35℃培养箱中培养24～48小时后放入2～8℃冰箱1小时后观察成果。培养基呈流体状，不是固体为阳性，否则为阴性。4.2.1.3.5葡萄糖发酵实验（1）培养基：葡萄糖发酵管（2）办法与成果：用无菌吸管吸取4.2.1.3.4中的菌悬液，滴加1～2滴于葡萄糖发酵管中，30～35℃培养箱中培养18～24小时后观察成果。培养基呈绿色或蓝色，为阴性，否则为阳性。4.2.1.4成果判断纯培养物的菌落形态均一且符合形态学特性，×100油镜下观察呈红色短链状杆菌，触酶实验、氧化酶实验、绿脓菌素实验、明胶液化实验皆为阳性，葡萄糖发酵实验为阴性者，即可鉴定为铜绿假单胞菌。4.2.2金黄色葡萄球菌4.2.2.1纯培养用接种环沾取菌落/菌液于胰酪大豆胨琼脂斜面或胰酪大豆胨琼脂平板上划线，置于30～35℃培养箱中培养18~24小时后，做下列检查。4.2.2.2形态学鉴定4.2.2.2.1菌落形态：菌落呈金黄色，圆形凸起，边沿整洁，外围有黄色环。4.2.2.2.2革兰氏染色及镜检革兰氏染色（见4.1.2.3）、镜检（4.1.2.4）；革兰氏染色鉴定成果：菌体呈紫色，为革兰氏阳性菌（G+）。镜检鉴定成果：革兰氏阳性球菌，无芽孢，呈不规则葡萄状。4.2.2.3生化特性鉴定4.2.2.3.1菌悬液的制备使用接种环挑取TSA平板上的新鲜菌苔至生理盐水中，摇匀，使菌液浊度与比浊管相似（比浊管使用前应充足震荡混匀），制成菌悬液。4.2.2.3.2触酶实验（1）试剂：3%过氧化氢溶液（2）办法与成果：使用接种环大量挑取TSA平板上的新鲜菌苔至3%过氧化氢溶液安剖管中，观察成果。立刻产生大量气泡为阳性，否则为阴性。4.2.2.3.3甘露醇发酵实验（1）培养基：甘露醇发酵管（2）办法与成果：用无菌吸管吸取4.2.2.3.1中的菌悬液，滴加1～2滴于甘露醇发酵管中，33～35℃培养箱中培养20~24小时。培养基变黄色为阳性，否则为阴性。4.2.2.3.4蔗糖发酵实验（1）培养基：蔗糖发酵管（2）办法与成果：用无菌吸管吸取4.2.2.3.1中的菌悬液，滴加1～2滴于蔗糖发酵管，33～35℃培养箱中培养20~24小时。培养基变黄色为阳性，否则为阴性。4.2.2.3.5血浆凝固酶实验（1）试剂：冻干兔血浆（2）培养基：脑心浸出液肉汤（BHI）（3）办法与成果：用无菌吸管吸取4.2.2.3.1中的菌悬液，滴加1～2滴于脑心浸出液肉汤（BHI）33～35℃培养20～24小时，肉汤应浑浊。使用无菌吸管，将上述BHI的细菌培养液全部加入至兔血浆管中，使兔血浆冻干粉溶解，33～35℃培养4小时。血浆发生凝固，呈半固体状为阳性，否则为阴性。4.2.2.4成果判断纯培养物的菌落形态均一且符合形态学特性，×100油镜下观察呈紫色球菌，触酶实验、甘露醇发酵实验、蔗糖发酵实验、血浆凝固酶实验皆为阳性者，即鉴定为金黄色葡萄球菌。4.2.3大肠埃希菌（B款）4.2.3.1纯培养用接种环沾取菌落/菌液于胰酪大豆胨斜面琼脂或胰酪大豆胨琼脂平板上划线，置于30～35℃培养箱中培养24小时后，做下列检查。4.2.3.2形态学鉴定4.2.3.2.1菌落形态：菌落半透明白色，表面光滑湿润。4.2.3.2.2革兰氏染色及镜检革兰氏染色（见4.1.2.3）、镜检（4.1.2.4）革兰氏染色鉴定成果：菌体呈红色为革兰氏阴性菌（G－）。镜检鉴定成果：革兰氏阴性短杆菌，无芽孢。4.2.3.3生化鉴定4.2.3.3.1糖发酵实验从平板上挑取纯培养物菌落无菌接种于乳糖发酵管中，30～35℃培养24～48小时，或几小时甚至更长时间培养。产酸：培养基中批示剂呈酸性反映变黄色，“+”；产气：培养基倒置的杜氏小管有气泡；固体培养基可出现开裂等现象，“+”。4.2.3.3.2靛基质实验（I）将纯培养物接种于蛋白胨水培养基中，于36±1℃培养24～48小时，滴加柯凡克试剂数滴于培养液面，轻轻摇动。阳性反映：在培养基上部有一红色环阴性反映：黄色、桔黄色或棕色。4.2.3.3.3甲基红实验（M）（1）试剂：甲基红0.1g，95%乙醇300ml。将甲基红研磨溶解于乙醇中，再加蒸馏水至500ml制成。（2）培养基：磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基（3）办法与成果：将纯培养物接种于上述培养基中，经36±1℃培养48小时，于管内加入甲基红批示剂数滴，立刻观察成果，呈红色者为阳性，呈黄色者为阴性。4.2.3.3.4乙酰甲基甲醇生成实验（V-P）将纯培养物接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水中，36±1℃培养48±2小时，于2ml培养液先加入甲液1ml（6%α奈酚酒精溶液）混匀，再加乙液（40%KOH溶液）0.4ml，充足摇动，如4h内出现红色为阳性，无红色反（黄色或铜色）为阴性。4.2.3.3.5枸橼酸盐运用实验（C）将纯培养物接种到枸橼酸盐培养基斜面上，于36±1℃培养48～72小时。斜面培养基上有菌生长，培养基由绿色变为蓝色为阳性反映；培养基无菌生长，斜面仍为绿色为阴性反映。4.2.3.4成果判断纯培养物的菌落形态均一且符合形态学特性，×100油镜下观察呈红色短杆状，为革兰氏阴性菌，乳糖发酵产酸产气或产酸不产气，IMViC实验＋＋－－或－＋－－，即鉴定为大肠埃希菌。4.2.4枯草芽孢杆菌4.2.4.1纯培养用接种环沾取菌落/菌液于胰酪大豆胨琼脂斜面或胰酪大豆胨琼脂平板上划线，置于30～35℃培养箱中培养18~24小时后，做下列检查。4.2.4.2形态学鉴定4.2.4.2.1菌落形态：菌落浅褐色、不规则、扁平，干燥有褶皱。4.2.4.2.2革兰氏染色及镜检革兰氏染色（见4.1.2.3）、镜检（4.1.2.4）革兰氏染色鉴定成果：菌体呈紫色或蓝紫色，为革兰氏阳性菌（G+）镜检鉴定成果：紫色或蓝紫色杆菌。4.2.4.3生化鉴定4.2.4.3.1菌悬液的制备使用接种环挑取TSA平板上的新鲜菌苔至生理盐水中，摇匀，使菌液浊度与比浊管相似（比浊管使用前应充足震荡混匀），制成菌悬液。4.2.4.3.2触酶实验（1）试剂：3%过氧化氢溶液（2）办法与成果：使用接种环大量挑取TSA平板上的新鲜菌苔至3%过氧化氢溶液管中，观察成果。立刻产生大量气泡为阳性，否则为阴性。4.2.4.3.3硝酸盐还原实验（1）试剂：硝酸盐还原试剂（甲液和乙液）（2）培养基：硝酸盐肉汤（3）办法与成果：用无菌吸管吸取4.2.4.3.1中的菌悬液，滴加1～2滴于硝酸盐肉汤中，30～35℃培养箱中培养48小时或更长时间后，向试管内滴加硝酸盐还原试剂甲液、乙液各3滴，观察成果。试管中液体呈橘红色或红色为阳性，否则为阴性。4.2.4.3.4甘露醇发酵实验（1）培养基：甘露醇发酵管（2）办法与成果：用无菌吸管吸取4.2.4.3.1中的菌悬液，滴加1～2滴于甘露醇发酵管，30～35℃培养箱中培养24~48小时，观察现象。培养基变黄色或黄绿色为阳性，否则为阴性。4.2.4.3.5V-P实验（1）试剂：V-P试剂（甲液和乙液）（2）培养基：缓冲葡萄糖蛋白胨水（3）办法与成果：用无菌吸管吸取4.2.4.3.1中的菌悬液，滴加1～2滴于缓冲葡萄糖蛋白胨水中，30～35℃培养箱中培养48小时或更长时间后，滴加V-P试剂甲液6滴。乙液2滴，30～35℃继续培养4小时。培养基变红色为阳性反映，否则为阴性。4.2.4.3.6阿拉伯糖发酵实验（1）培养基：阿拉伯糖发酵管（2）办法与成果：用无菌吸管吸取4.2.4.3.1中的菌悬液，滴加1～2滴于阿拉伯糖发酵管，30～35℃培养箱中培养24~48小时，观察现象。培养基变黄色或黄绿色为阳性，否则为阴性。4.2.4.3.7精氨酸双水解酶实验（1）试剂：无菌液体石蜡（2）培养基：精氨酸脱羧酶肉汤，精氨酸脱羧酶对照液（3）办法与成果：用无菌吸管吸取4.2.4.3.1中的菌悬液，分别滴加1～2滴于精氨酸脱羧酶肉汤和精氨酸脱羧酶对照液中，接种后覆盖4～6滴液体石蜡30～35℃培养箱中培养2天，精氨酸脱羧酶肉汤管和精氨酸脱羧酶实验对照管均呈黄色或浅黄色，为阴性。4.2.4.4成果判断纯培养物的菌落形态均一且符合形态学特性，×100油镜下观察呈紫色或蓝紫色杆菌；触酶实验阳性，硝酸盐还原实验阳性，甘露醇发酵实验阳性，V-P实验阳性，阿拉伯糖发酵实验阳性，精氨酸双水解酶实验阴性，则鉴定为枯草芽孢杆菌。4.2.5白色念珠菌4.2.5.1纯培养用接种环沾取菌落/菌液于沙氏葡萄糖琼脂斜面或沙氏葡萄糖琼脂平板上划线，置于20～25℃培养箱中培养2~3天后，做下列检查。4.2.5.2形态学鉴定4.2.5.2.1菌落形态：菌落为乳白色，表面光滑。4.2.5.2.2显色培养基培养挑选2~3个菌落分别接种至念珠菌显色培养基平板上，25~30℃培养18~24小时（必要时延长至72小时）。再挑取平板上生