乙醇诱导的急性酒精性脂肪肝斑马鱼模型的建立

乙醇诱导的急性酒精性脂肪肝斑马鱼模型的建立

目前，酒精性肝炎已成为国内外研究的热点。酒精性脂肪肝是过量酒精摄入后出现的一个早期的和可逆的临床阶段,可进展成为酒精性肝炎、肝硬化甚至肝癌,应引起高度重视。为深入研究酒精性脂肪肝的发病机制,寻找有效的治疗和预防药物,需要建立一个简单易行而又经济实用的动物模型。传统的酒精性脂肪肝模型常以大鼠作为实验对象,多采用灌胃或腹腔注射酒精的方法,实验周期约为1～16周。然而操作复杂、样本量局限、实验耗费高且周期长等诸多缺点限制了其在高通量药物筛选方面的应用。本研究通过建立急性酒精性脂肪肝斑马鱼模型,弥补了鼠模型在高通量药物筛选方面的缺陷,以期为进一步研究本病的发病机制和药物筛选奠定实验基础。1材料和方法1.1材料表面1.1.1繁殖与培养模式由南方医科大学生命科学院细胞生物教研室斑马鱼平台提供野生型AB品系斑马鱼。斑马鱼根据Westerfield方法养殖:照明14h,黑暗10h交替进行,雌雄分开喂养,定时给予饲料。取卵前一天,将雌雄以1∶1的比例放入交配缸中,插入挡板,次日清晨拔开挡板,收集胚胎培养于28.5℃恒温培养箱中到5dpf。期间及时换水,剔除死卵。1.1.2药物和试剂油红O购于Sigma公司;无水乙醇和丙二醇由广东光华化学厂提供;苏木素和伊红染液为南京建成生物工程有限公司产品。1.2方法1.2.1斑马鱼处理组细胞组受精卵发育到5dpf,在体式显微镜下挑选肝脏发育正常的幼鱼288条,随机均分为对照组、2%乙醇处理组、2.5%乙醇处理组、3%乙醇处理组,每组72条,置于六孔板中。处理组加入相应体积浓度比无水乙醇,对照组给予斑马鱼培养用水(hank′ssolution)。为防止乙醇挥发,加盖后用Parafilm封条封闭,置于28.5℃培养箱内培养。于处理后4、24和32h三个时间点观察并记录各组生存率。1.2.2油红/丙二醇溶液收集斑马鱼于染色皿中,4%多聚甲醛固定过夜,PBS洗涤2次,丙二醇从低浓度到高浓度渗透,0.5%油红避光孵育过夜。同样浓度丙二醇从高浓度到低浓度洗净背景,80%丙二醇4℃冰箱保存。每组随机挑选20条,Olympusszx10体式显微镜下观察肝脏脂肪变性情况(肝脏脂滴数≥3评判为脂肪肝)并进行拍照记录。1.2.3病理组织4%多聚甲醛固定斑马鱼过夜,不同浓度酒精脱水,二甲苯透明,浸蜡后包埋,4μm切片,行HE染色,光镜观察肝脏病理变化。1.3均数标准差t应用SPSS16.0统计软件进行统计学分析,计量资料以均数±标准差(x¯±s)(x¯±s)表示,两组间比较采用两个独立样本t检验。作图用Sigmaplot10.0软件。P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1用乙醇处理后的斑点鱼一般情况2.1.1斑马鱼生存率测定乙醇对斑马鱼存活率的影响呈时间和浓度依赖性。2%、2.5%和3%乙醇处理组斑马鱼在处理后32h生存率分别为100%、(91.21±1.61)%和2%乙醇浓度为可耐受浓度,32h内并不引起斑马鱼死亡(图1)。2.1.2斑马鱼的行为与对照组相比,2%乙醇处理组斑马鱼处理24h时形态基本正常,观察其活动度增加,游动异常,表现为转圈、窜动。3%乙醇处理24h后存活下来的斑马鱼静止不动,全部出现畸形(图2)。2.5%乙醇处理组斑马鱼中部分出现畸形。2.2脂滴和2%乙醇处理对肝损伤的影响整体油红染色观察肝脏脂肪变性情况(肝脏脂滴数≥3评判为脂肪肝)(图3a)。显微镜下分离对照组和2%乙醇处理组斑马鱼肝脏组织,发生脂肪变性后肝脏染色明显变深,肝内有点状脂滴沉积,严重的脂滴布满全肝(图3b)。2%乙醇处理32h后肝脏明显肿大,肝内染色加深,有点状脂滴沉积(图3c)。根据上述评判标准,统计分析两组脂肪肝发生率:与对照组相比,2%乙醇处理组32h后脂肪肝发生率明显增高[(71.25±0.15)%vs(31.25±0.05)%,t=5.102,P=0.002],而24h时,两组脂肪肝发生率差异无统计学意义[(17.50±0.15)%vs(7.50±0.05)%,t=1.265,P=0.253](图3d)。2.3斑马鱼肝脏急性毒性HE染色结果显示对照组肝组织形态学表现正常,2%乙醇处理组斑马鱼处理32h后肝细胞明显肿胀,脂滴将核挤至一边,肝内可见微多孔状的脂滴(图4)。3斑马鱼的建模研究酒精性脂肪肝是过量酒精摄入后出现的一个早期的和可逆的临床阶段,研究表明脂肪化的肝细胞更容易受到氧化压力、内毒素和药物等因素的“二次打击”,从而导致病情的进一步发展。脂肪肝临床症状不易察觉,往往被患者忽略,多数研究关注其后期病变,然而针对酒精性脂肪肝发病机制的探索、药物筛选同样重要。为深入酒精性脂肪肝发病机制和防治基础研究,选择一种理想的实验动物模型十分必要。经典Liber-Decarli模型采用含酒精和全营养素的液体食料喂养大鼠,但由于大鼠厌酒,故而不能保证大鼠有较恒定的酒精摄入量。Tsukamato-French大鼠模型虽能控制实验动物的酒精摄入,但制作该模型需要一些技术上的训练,如胃内导管的植入、维持,以保证24h持续注入酒精。所需的特殊设备价格昂贵,给人们的研究带来诸多不便。在此基础上,国内的一些学者也致力于酒精性脂肪肝大鼠模型的改良工作,但始终存在着操作复杂、难于大规模饲养、实验耗费高且周期较长的问题,限制了其在高通量药物筛选方面的应用。近年来,斑马鱼因87%的基因与人类同源、具有体外受精和胚胎透明、易于养殖和在体观察、方便控制实验条件和检测等独特优点。被广泛应用于疾病模型的建立和药物筛选中。其在肝脏领域的研究层出不穷,如已经建立的脂肪肝、非酒精性脂肪肝、药物性肝损害、肝癌模型,给了我们许多启示[15,16,17,18,19,20]。与此同时,有研究指出斑马鱼体内拥有代谢酒精所需的关键酶,肝脏在胚胎发育的第4d便开始成熟,酒精可以直接加入水中,是进行酒精性肝病研究的理想模式生物。本研究通过直接在斑马鱼培养用水中加入酒精的方法成功地建立急性酒精性脂肪肝斑马鱼模型。此模型相对传统大鼠模型有以下优点:(1)酒精是直接加入养鱼水中,相对灌胃法或腹腔注射的方法操作较简便;(2)幼鱼是透明的,整体油红染色后显微镜下可以直接观察肝内脂滴沉积情况;(3)斑马鱼产卵多,繁殖快,价格低廉,易于进行高通量药物筛选;(4)诱导脂肪肝的时间相对较短,有效的缩短了实验周期。以斑马鱼为模式生物建立模型,克服了传统大鼠模型存在的问题,为进一步研究本病的发病机制和高通量药物筛选开辟了一条新路。2009年,Passeri等用浓度为2%的乙醇刺激4dpf的幼鱼32h后成功地建立了急性酒精性脂肪肝斑马鱼模型,本文建立的模型与其有以下区别:(1)鱼的大小不同:文献中报道斑马鱼在胚胎受精后的第4d肝脏开始发育,前4d卵黄囊能够自身提供营养物质,无需喂食。如果禁食到第6d,斑马鱼易自发形成脂肪肝。因此实验用鱼为4dpf最佳。但经过观察发现到5dpf时斑马鱼肝脏发育更加完善,卵黄囊几乎消失,油红染色时能排除卵黄囊区域对肝脏的影响。所以我们选择5dpf的斑马鱼建立模型。(2)相同浓度乙醇处理后对斑马鱼生存率的影响不同:与国外报道一致,2%乙醇处理后斑马鱼在32h内不出现死亡。3%乙醇处理32h后斑马鱼全部死亡,而在其报道中仍有20%～30%的斑马鱼存活。我们考虑由于地域差别等因素,斑马鱼对乙醇的耐受力仍有一定区别。值得提出的是,在Passeri等的研究中,他们在此模型的基础上进一步利用突变体斑马鱼揭示了srebp基因的激活在急性酒精性脂肪肝发病过程中起着关键性作用。这使得我们相信利用斑马鱼从分子水平研究疾病发生已不再是个难题