3,5-二硝基水杨酸比色法测定甘蔗茎节总糖和还原糖含量

3,5-二硝基水杨酸比色法测定甘蔗茎节总糖和还原糖含量

0分离的谱法和液相色谱法恢复糖的测定对于全面研究甘蔗茎的利用具有重要意义。有关总糖和还原糖含量的测定有多种方法,如旋光法、气相色谱法、液相色谱法、分光光度法等。旋光法测量准确性较差;气相色谱法和液相色谱法测量过程较复杂;3,5-二硝基水杨酸法(DNS)具有准确性高、重现性好、特别适用于大批量样品的测定等特点而被广泛采用;在植物糖的测定中,仍未见到有同时用DNS法测定总糖和还原糖的报道。然而DNS法过程中的诸多因素如吸收光谱、显色剂用量、显色时间等均对测定结果的准确性有直接影响,为了能准确的测定甘蔗总糖和还原糖含量,我们对用3,5-二硝基水杨酸比色法测定甘蔗茎节总糖和还原糖含量的反应条件进行一系列的试验,试图摸索出最佳的试验条件以保证试验的最佳精确度,以期获得可靠的数据为甘蔗品质育种的实践提供参考。1材料和方法1.1试验材料中国热带农业科学院试验田取生长11个月拔地拉果蔗1.1.1样品中的糖转化拔地拉果蔗从生长点依次向下数取23节,榨汁,放4℃备用。1.1.2水解是否呈现变色分别取0.2mL的甘蔗汁加6mo1/mLHCl0.4mL,沸水浴30min。取出溶液1~2滴于白瓷板上,加1滴I-KI溶液检查水解是否完全,若水解完全则不呈现黄色。冷却后加入1滴10%酚酞指示剂,用6mol/mLNaOH溶液中和到微红色,定容至2mL后备用1.1.3仪器美国BechkmanCoulterDU800分光光度计。1.1.4ds和亚硫酸钠的合成1mg/mL葡萄糖标准液:准确称取0.1g的无水葡萄糖,待完全溶解后定容至100mL。DNS显色液:分别取6.3gDNS和262mL2MNaOH溶液,加至500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中,再加入5g结晶酚和5g亚硫酸钠,搅拌溶解冷却后加水定容至1000mL。贮存于棕色瓶中备用。酚酞指示剂:称取0.1g酚酞,溶解于250mL70%乙醇中。6MHCl和6MNaOH各100mL以上试剂均为分析纯。水为去离子水。1.2测试方法1.2.1葡萄糖标准液制备取0.75mL配制好的DNS溶液于10mL的试管中,加入0.4mL葡萄糖标准液,补加纯水至3mL,摇匀糖溶液;置于沸腾的水浴锅中加热5min取出,迅速用自来水冷却至室温;用蒸馏水定容至10mL。以DNS试剂调零,在420~700nm波长范围内测其吸光度。1.2.2复配体系中各管溶液的吸光度的测定在11支比色管内分别加入1mg/mL葡萄糖标准溶液0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、0.90、1.00mL,加入DNS试剂0.75mL,步骤同1.2.1测定,读出各管溶液的吸光度值。以葡萄糖含量为横坐标,各管吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。1.2.3吸光度测定准确吸取0.15mL葡萄糖标准液分别加入到13个10mL的比色管中,各加0.75mLDNS,并在沸水浴中煮2、3、4、5、6、7、8、10、12、14、16、18、20min,步骤同1.2.1,测定吸光值。1.2.4步骤2:某准确吸取甘蔗提取液0.4mL分别加入7支比色管,步骤1.2.3。显色后分别放置10min、20min、30min、40min、50min、1h、2h,步骤同1.2.1,然后测定吸光值。1.2.5dsi/dms吸光度测定为了保证显色完全,我们采用较高浓度葡萄糖的标准液来进行DNS用量的选择。准确吸取1.0mL的葡萄糖标准液分别加入8支10mL比色管中,分别加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mLDNS于试管中,步骤同1.2.1,测定吸光值。1.2.6还原糖量的测定样品按照1.2.5确定的条件处理后,测定吸光度,在葡萄糖标准曲线上分别查出相应的还原糖毫克数。按下式计算样品中总糖在每毫升蔗汁中所占的质量数,还原糖即为曲线所对应的葡萄糖量。每个样品设3个重复。总糖=查曲线所得水解后还原糖毫克数×稀释倍数×0.9×1001.2.7精密度实验按照1.2.6中样品的测定方法,同时取同一样品6份溶液,测定吸光度,计算标准偏差。1.2.8处理数据试验数据用EXCEL2000进行处理和作图,并采RSD法进行差异显著性分析。2结果与分析2.1光谱扫描波长的确定我们用DU800紫外可见分光光度计对反应生成的氨基化合物以及DNS溶液调零后进行吸收光谱扫描,结果见图1。入射光的波长应根据吸收光谱,以选择溶液具有最大吸收时的波长为宜,由图1可知选λmax=510nm为合适,这一点与朱海霞等的报道相一致。我们在此波长下确定显色时间以及由绘制出的葡萄糖含量与吸光度的曲线关系最终确定测量还原糖的合适范围。2.2标准曲线图2从图2我们可以发现,葡萄糖含量(mg/mL)与相应的吸光度(A)有一定的线性关系。2.3测定时间的选择图3可见,显色液在显色之后的4h内,其吸光度逐渐减小,可根据对还原糖含量精确度的要求选择测定时间,即精确度要求高应及早测定,若进行大批量样品的还原糖筛选,则可将显色液样品集中测定以提高工作效率。2.4显色时间的确定图4可见,前6.0min内3,5-二硝基水杨酸由于被迅速还原而吸光度急剧增大,在显色7min之后吸光度的变化趋于平缓,即显色时间在7min即可。2.5ds试剂用量DNS试剂用量与待测液中还原糖的含量息息相关。图5可见,当DNS试剂用量小于0.8mL时,溶液吸光度随DNS剂用量的增加而增大,当DNS试剂用量大于0.8mL,吸光度则基本保持不变。因此,DNS试剂的最佳用量为0.8mL。2.6样品测定样品的测定结果见图6和图7,能够正确反映总糖和还原糖在甘蔗茎中的积累规律并与McCormick等结果一致。2.7精密试验表13最佳试验波长的确定在国内首次将DNS法应用于同时测定甘蔗茎节总糖与还原糖,然而应用3,5-二硝基水杨酸比色法测定还原糖含量对最佳吸收光谱的确定,不同的作物需要采用不同的检测条件。这些均与常规方法中的λmax=540nm有所不同。这可能由于最佳波长的确定受到仪器性能、灵敏度、试验对象中还原糖含量、可溶性物质种类及DNS用量等因素的影响。因此应根据自己的试验对象和仪器设备来确定试验所需的最佳条件。通过对应用3,5-二硝基水杨酸比色法测定甘蔗总糖和还原糖含量的影响