灯盏花素对肝纤维化模型大鼠gf

灯盏花素对肝纤维化模型大鼠gf

灯盏花素是从灯豆花中提取的黄酮类，具有广泛的生理活性。肝星状细胞(hepaticstellatecell,HSC)与肝纤维化形成密切相关。在慢性损伤因素的持续作用下,肝内分泌大量细胞因子,其中最主要的是转化生长因子(transforminggrowthfactor-β,TGF-β),它们在肝组织内沉积,使HSC活化,同时细胞的表型也向成纤维样细胞转变,表达α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscleactin,α-SMA)。本文主要研究Bre对大鼠HSC分泌TGFβ1、α-SMA的干预作用,探讨HSC抗肝纤维化作用的可能机制。1材料和方法1.1材料表面1.1.1实验动物纯系Wistar大鼠60只,雌、雄各半,2～3月龄,体重200～250g,由佳木斯大学动物实验中心提供。1.1.2rt-pcr法Bre片(神威药业有限公司);CCl4(郑州化学试剂二厂);RT-PCR试剂盒(大连宝生物有限公司);TGFβ1免疫组化试剂盒、α-SMA免疫组化试剂盒(武汉博士得生物工程有限公司产品)。1.2方法1.2.1实验大鼠肝纤维化模型将60只Wistar大鼠随机分为6组:正常对照组(NOR)、模型组(MOD)、Bre低剂量组(DD)、中剂量组(DZ)、高剂量组(DG)、秋水仙碱组(COLC),每组10只,各组间暴露因素无差别(P>0.05)。用CC14腹腔注射法诱导大鼠肝纤维化模型,40%植物油溶液(1ml/kg),2次/w,共8w,同时用乙醇取代清水作为唯一水源。NOR组腹腔注射生理盐水。于造模成功后(第8周末),Bre干预组给予灯Bre灌胃:浓度5、10、20mg/kg;COLC组按0.1mg/kg体重剂量灌胃,同时正常对照组与模型组给予等量生理盐水灌胃。于第12周末处死各组实验动物,收集血清及肝脏标本待检。1.2.2肝组织-sma、tgf13(1)血清丙氨酸转氨酶(alanineaminotransferase,ALT)、天冬氨酸转氨酶(aspartateaminotransferase,AST)采用全自动生化分析仪检测。(2)免疫组织化学法检测肝组织α-SMA、TGFβ1:肝组织石蜡切片常规脱蜡至水,3%H2O2去离子水,灭活内源性酶。将切片浸入0.02mol/LpH7.2～7.6磷酸盐缓冲液(PBS),微波炉加热抗原修复,后放置室温自然冷却30min。5%小牛血清(BSA)封闭液37℃孵育15min。滴加一抗,4℃过夜。滴加山羊抗兔IgG抗体-HRP多聚体。二氨基联苯胺(DAB)显色,苏木素复染,脱水,透明,封片。1.2.3pcr扩增条件以合成的cDNA为模板进行扩增反应。用β-连环蛋白(β-actin)作为内参,上、下游引物分别为S:TGCCCATCTATGAGGGTTAC,A:CTGGAAGGTGGACAGTGAG,扩增片段长度为572bp,退火温度为59℃。α-SMA上下游引物分别为S:5′-ACTGGTATTGTGCTGGACTC-3′,A:5′-TGCTGTTATAGGTGGTTTCG-3′,退火温度为58℃,扩增片段长度为400bp;TGF-β1上下游引物分别为S:5′-TAATGGTGGACCGCAACAAC-3′,A:5′-GTGAGCACTGAAGCGAAAGC-3′,退火温度为57℃,扩增片段长度为332bp。PCR反应条件为94℃2min预变性,然后94℃30s,退火温度30s,72℃90s,35个循环,结束前72℃延伸10min,4℃保存。PCR产物与上样缓冲液按4∶1混合,每孔道加8μl混合液,上样后于电泳槽中电泳,电压为80V,时间为40min,EB中染色15min,结果用凝胶成像系统扫描,用目的基因区带的灰度值与内参β-actin区带的灰度值之比为目的基因的表达水平。1.3统计处理应用SPSS17.0统计分析软件,实验结果以x¯±sx¯±s表示,进行方差分析、组间差异性检验用q检验。2结果2.1alt和ast的比较MOD组大鼠血清ALT、AST明显高于NOR组。与MOD组相比较,DZ组、DG组ALT、AST均明显降低(P<0.05),DD组ALT降低(P<0.05),而AST无明显差异。见表1。2.2各组大鼠血清中-sma、dg、tgf1显色指数的比较NOR组α-SMA只表达于小动脉及小静脉,在胆管无表达。MOD组α-SMA主要表达于汇管区及纤维间隔,且呈长椭圆形或梭形。与NOR组比较,MOD组α-SMA免疫组织化学显色指数明显升高(P<0.01)。COLC组、DZ组和DG组α-SMA显色指数的表达较MOD组显著下调(P<0.01),其中DZ、DG组与COLC组的α-SMA显色指数的表达无明显差异(P>0.05)。DD组α-SMA显色指数与MOD组比较无明显差异(P>0.05)。见表2。与NOR组比较,MOD组TGFβ1免疫组织化学显色指数明显升高(P<0.01)。COLC组、DG组和DZ组TGFβ1显色指数的表达较MOD组显著下调(P<0.01),其中DG组、DZ组与COLC组的TGFβ1显色指数的表达无明显差异(P>0.05)。DD组TGFβ1显色指数与MOD组比较无明显差异(P>0.05)。见表2。2.3rt-pcr结果2.3.1各组大鼠血清中-sma基因表达的比较MOD组与NOR组α-SMAmRNA有显著性差异(P<0.01);不同剂量Bre作用于肝纤维化大鼠4w后,各剂量组和COLC组均能使α-SMAmRNA表达显著降低(P<0.01)。三个剂量组之间α-SMAmRNA有显著性差异(P<0.05);DG组与DD组之间α-SMAmRNA有非常显著性差异(P<0.01);DD组与COLC组之间有显著差异(P<0.05)。DG组、DZ组与COLC组之间差异不显著无统计学意义。见表3,图1。2.3.2bre对肝纤维化大鼠tgf2mrna表达的影响mRNA表达的影响MOD组与NOR组TGFβ1mRNA有显著性差异(P<0.01);不同剂量Bre作用于肝纤维化大鼠4w后,Bre不同剂量组和COLC组均能使TGFβ1mRNA表达显著降低(P<0.01,P<0.05)。DD组与DZ组之间TGFβ1mRNA表达有显著性差异(P<0.05);DD组、DG组与COLC组之间有显著差异(P<0.05)。DZ与COLC组之间差异不显著无统计学意义。见表3,图2。3对肝纤维化中-sma表达的调控肝纤维化发生、发展机理的研究认为:HSC活化是肝纤维化形成的关键。活化HSC的是细胞外基质(ECM)的主要来源。正常肝组织中只有血管和胆管平滑肌细胞表达α-SMA,慢性肝病时,前炎性细胞因子等诱导HSC活化、增殖并转化为肌成纤维母细胞表形,因此是否表达α-SMA可作为鉴别HSC是否激活的标志,所以α-SMA作为HSC活化的主要标志物,与HSC活化的程度及数量呈正相关,抑制和减少HSCα-SMA的表达,便可达到抑制其激活,抑止纤维化的作用。研究表明TGF-β是最强的肝纤维化促进剂,HSC是TGF-β在纤维化进程中最重要的来源,下调TGFβ1可通过诱导其他细胞因子的产生及其受体在HSC上的表达;促进细胞外基质合成并抑制其降解等方面抑制肝纤维化的发生和发展。实验结果显示DG组、DZ组可以保肝降酶,防治肝