第11章 气相色谱法和高效液相色谱法

第11章气相色谱法和高效液相色谱法§11-1色谱分析理论基础§11-2色谱定性与定量分析方法§11-3气相色谱法概述§11-4气相色谱固定相§11-5气相色谱检测器§11-6气相色谱操作条件的选择§11-7毛细管气相色谱法简介§11-8高效液相色谱法概述§11-9高效液相色谱仪§11-10高效液相色谱法的主要分离类型§11-11高效液相色谱法分离类型的选择

§11-1色谱分析理论基础

一、概述色谱法又名色层法、层析法。色谱法的产生：由Tsweet于1906年创立。Tsweet在研究植物叶色素成分时，得名“色谱法”的分离方法。到了1931年，Kuhn等用同样的方法成功地分离了胡萝卜素和叶黄素，开始为人们所重视。现在，“色谱法”已广泛用于无色物质的分离，“色谱”已失去了它原来“色”的含义，但其名称一直沿用至今。

色谱法(chromatography)：以试样组分在固定相和流动相间的溶解、吸附、分配、离子交换或其他亲和作用的差异为依据而建立起来的各种分离分析方法称色谱法。色谱柱：进行色谱分离用的细长管。固定相：（stationaryphase）

管内保持固定、起分离作用的填充物。流动相：（mobilephase）流经固定相的空隙或表面的冲洗剂。

色谱分析法：将色谱法应用于分析化学中，并与适当的检测手段结合，就构成了色谱分析法。通常简称“色谱法”色谱仪：用以完成色谱分离、分析过程的仪器。其一般流程为流动相→进样装置→色谱柱→检测器→数据记录与处理

皂膜流量计转子流量计调整仪，标准仪SetupofGasChromatograph

按固定相的几何形式分类：

1.柱色谱法，

2.纸色谱法，

3.薄层色谱法。按两相所处的状态分类 ：

气相色谱法液相色谱法气-固色谱法液-固色谱法气-液色谱法

液-液色谱法本章着重讨论气相色谱法和高效液相色谱法。

二、色谱分离基本原理以气相色谱为例说明色谱的分离原理。色谱柱:主要有2种，为填充柱和毛细管柱；气固色谱和气液色谱。气固色谱：固定相为，多孔性的固体吸附剂。分离是主要基于固体吸附剂对试样中各组分的吸附能力的不同。气液色谱：固定相为，担体+固定液。分离是主要基于固定液对试样中各组分的溶解度的不同。即基本分离过程：基于吸附-脱附-吸附-脱附-……

或溶解-挥发-溶解-挥发-……的分离过程——分配过程

分配过程达到平衡时，平衡程度可用分配系数或容量因子衡量。分配系数K：在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度比。

因此，色谱法是利用不同物质在流动相和固定相两相间分配系数的不同，经过反复多次的分配，而实现分离的方法。即K的差异是实现分离的前提，表征了分离的可能性。容量因子k

（容量比，分配比；实际应用中常用）：指在一定温度和压力下，组分在色谱柱中达分配平衡时，在固定相与流动相中的质量比——更易测定。

β为相比，等于VM/VS,反映各种色谱柱柱型及其结构特征。如：填充柱（Packingcolumn）:6~35

毛细管柱（Capillarycolumn）:50~1500图1、色谱过程图2、色谱图KA>KB

三、色谱流出曲线及有关术语

试样中各组分经色谱柱分离后，按先后次序经过检测器时，检测器就将流动相中各组分浓度变化转变为相应的电信号，由记录仪所记录下的信号——时间曲线或信号——流动相体积曲线，称为色谱流出曲线，或色谱图。是色谱定性、定量和评价色谱分离情况的基本依据。

色谱图界面

常用术语：基线：在操作条件下，仅有纯流动相进入检测器时的流出曲线。峰高与峰面积：色谱峰顶点与峰底之间的垂直距离称为峰高(peakheight)。用h表示。峰与峰底之间的面积称为峰面积(peakarea)，用A表示。峰的区域宽度：

a、峰底宽WD=4σb、半高峰宽Wh/2=2.355σc、标准偏差峰宽W0.607h=2σ

保留值:

1)保留时间

：从进样至被测组分出现浓度最大值时所需时间tR。

2)保留体积：从进样至被测组分出现最大浓度时流动相通过的体积，VR。

死时间：

不被固定相滞留的组分，从进样至出现浓度最大值时所需的时间称为死时间(deadtime)，tM。死体积:

不被固定相滞留的组分，从进样至出现浓度最大值时流动相通过的体积称为死体积(deadvolume)，VM。（F0为柱尾载气体积流量）

VM=tM

F0

调整保留值:

1)调整保留时间：扣除死时间后的保留时间。

tR׳=tR–tM

2)调整保留体积：扣除死体积后的保留体积。

VR׳=VR–VM

或VR׳=tR׳F0相对保留值（relativeretention）在相同的操作条件下，待测组分与参比组分的调整保留值之比，用ri，s

表示

由此可知：相对保留值应该与柱长、柱径、填充情况、流动相流速等条件无关，而仅与温度、固定相种类有关。相对保留值有时也称为选择性因子，用α表示。

依据色谱图上的色谱峰流出曲线可说明什么问题？（1）根据色谱峰的数目，可判断样品中所含组分的最少个数；（2）根据峰的保留值进行定性分析；（3）根据峰的面积或高度进行定量分析（4）根据色谱峰的展宽程度，可以对某物质在实验条件下的分离特性进行评价；（5）根据两峰间的距离，可评价固定相选择是否合适。

四、色谱柱效能

1、塔板理论（MartinandSynge1941）

塔板理论认为，一根柱子可以分为n段，在每段内组分在两相间很快达到平衡，把每一段称为一块理论塔板。设柱长为L，理论塔板高度为H，则

H=L/n式中n为理论塔板数。理论塔板数（n）可根据色谱图上所测得的保留时间（tR）和峰底宽（w）或半峰宽（wh/2

）按下式推算：或

有效塔板数（neff）的计算公式为:

Heff=L/neff

通常用有效塔板数（neff）来评价柱的效能比较符合实际。neff

越大或Heff越小，则色谱柱的柱效越高。

2、速率理论（J.J.VanDeemter1956）

速率理论认为，单个组分粒子在色谱柱内固定相和流动相间要发生千万次转移，加上分子扩散和运动途径等因素，它在柱内的运动是高度不规则的，是随机的，在柱中随流动相前进的速度是不均一的。

A项为涡流扩散项；B/u项为分子扩散项；

Cu为传质项，；u为载气线速度，单位为cm/s。下面以气相色谱法为例说明各项物理意义：

范第姆特方程式(VanDeemterequation)提出了一个联系各影响因素的方程式：

涡流扩散项：组分粒子随流动相远动受到填料颗粒的阻力不同，致使同一溶质的不同分子在通过填料的过程中所走的路径不一样，类似于“涡流”的流动，称之为涡流扩散。图示涡流扩散引起的色谱峰展宽。

担体粒度填充不规则因子

分子扩散项：是组分粒子在移动方向上向前和向后的扩散，即x轴方向的扩散。它是由浓度梯度所引起。样品从柱入口加入，样品带像一个塞子随流动相向前推进，由于存在浓度梯度，塞子必然会自发地向前和向后扩散，引起谱带展宽。纵向扩散引起的峰展宽的大小由下式决定：图13－9色谱柱中的分子扩散项uDuBgg2=弯曲因子≤1组分在气相中的扩散系数

传质阻力项

Cu=(Cm+Cs)u流动相传质阻力项：组分粒子要从流动相转移到固定相中，就要从流动相主体扩散到气-液或气-固界面，阻碍这一扩散过程的阻力称流动相传质阻力。固定相传质阻力项：组分粒子到达两相界面后，将继续扩散到固定相内部达到分配平衡，然后又返回到两相界面。溶质在这一移动过程中的阻力称固定相传质阻力。组分在固定相中的扩散系数组分在流动相中的扩散系数

色谱柱的总理论塔板高度H可以表示如下：

综上所述，组分在柱内运行的多路径，浓度梯度造成的分子扩散和组分在气液两相质量传递的不能瞬间达到平衡，是造成色谱峰扩展，柱效能下降的原因。该方程为分离操作条件的选择提供了理论指导。有些因素的影响以彼此相反的效果出现，如流速、温度等。应适当选择。

3、分离度（resolution）

相邻两色谱峰保留值之差与两组分色谱峰底宽度平均值之比，用R表示。分离度可以用来作为色谱柱的总分离效能的指标。

★R越大，表明两组分分离效果越好★保留值之差取决于固定液的热力学性质★色谱峰宽窄反映色谱过程动力学因素及柱效能高低

对于峰形对称且满足正态分布的色谱峰：R=1,分离程度为98%；

R=1.5，分离程度可达99.7%。

所以R=1.5时可认为色谱峰已完全分开。

色谱分离关系式

设两相邻峰的峰宽相等，即w1=w2，则

又知称为柱效项；称为柱选择项；与柱效的关系增加柱长限制：L过长，保留时间延长，分析时间延长，色谱峰扩展。减小塔板高度使用性能优良的色谱柱，并选择最佳分离条件-----分离度、柱效、柱选择性的关系

与柱选择性的关系

r2,1越大，柱选择性越好，分离效果越好。如果两个相邻峰的选择因子足够大，则即使色谱柱的理论塔板数较小，也可以实现分离。

根据上述关系，可估算所需色谱柱长：

L=16R2•H有效aa-12=n有效•H有效

例题：设有一对物质，其r2,1=α=1.15,要求在Heff=0.1cm的某填充柱上得到完全分离，试计算至少需要多长的色谱柱？解：要实现完全分离，R≈1.5,故所需有效理论塔板数为： 使用普通色谱柱，有效塔板高度为0.1cm,故所需柱长应为：

§11-2色谱定性与定量分析方法色谱定性分析的目的是确定每个色谱峰各代表什么组分。定性能力总体弱，但联用技术展现应用前景。

一、色谱定性方法

1、利用保留值的定性方法当固定相和操作条件严格固定不变时，每种物质都有确定的保留值，为定性基础。但定性能力不强。

利用保留值tR、

VR

、ri，s等可作定性鉴定的指标，相对来说ri，s作为定性指标更为可靠。鉴定的方法，除了在相同的条件下比较待测组分的保留值与纯物质的保留值外，还可利用加入纯物质以增加峰高法，或采用双柱或多柱定性法进行分析。

但必须要有适当的标准物质，否则可利用文献中发表的保留指数或相对保留值数据来定性鉴定。

2、与质谱、红外、核磁共振等仪器联用的定性鉴定如GC-MS，是目前应用最广的有效工具。此外，与化学方法结合或利用检测器的选择性进行定性鉴定，也能提高定性鉴别力。

二、色谱定量方法

1、色谱定量公式：

mi=fi′•Aimi

：待测物质质量fi

′

：待测物质定量校正因子Ai

：待测物质色谱峰的积分面积色谱定量关键：①准确测量峰面积；②求出定量校正因子；③选择定量方法。

2、色谱峰的面积求法：峰高乘半峰宽法 峰高乘平均峰宽法峰高乘保留值法微机的应用（电子积分法）

3、定量校正因子（Quantitativecalibrationfactor）

绝对校正因子：相对校正因子：用标准物质为参照物、求出待测物质与标准物之间绝对校正因子的比值。对热导池检测器的标准物是苯、对氢火焰离子化检测器的标准物是正庚烷。

当m用质量单位时，所得的相对校正因子为“相对质量校正因子”（fm）

；而采用摩尔为单位时，得到“相对摩尔校正因子”（fn）。

应用时常将“相对”二字省去，可从文献中查到，也可以自行测定。

4、几种常用定量方法

（1）归一化法：若样品中所有的组分均能流出色谱柱且有较好的、可分辨的色谱峰时可用此法定量。

（2）内标法：若样品中除待测的几个色谱峰有良好分离，但其它所有的组分不能全部流出色谱柱或有不可分辨的色谱峰时可用此法定量。

常以内标物基准：

内标标准曲线法：如果经常需要测定同一物质，可固定试样的称取量，并加入恒定量的内标物，此时fi

mS

/fs

m为一常数故：

wi∝Ai/ASFigureInternalworkinggraph适合于液体试样的常规分析

（3）外标法：应用欲测组分的纯物质来制作标准曲线。

绘制标准曲线：配成不同含量(％)标准——用欲测组分的纯物质加稀释剂(对液体样品用溶剂稀释、气体样品用载气或空气稀释)，取固定量标准进样分析，绘制响应讯号(峰面积或峰高等)对百分含量(横坐标）的标准曲线。

分析试样：取同样量的试样(固定量进样)，测得该试样的响应讯号，由标准曲线即可查出其百分含量。

SignalwiAiwi国产气相色谱仪§11-3气相色谱法概述

一、气相色谱法的特点分离效能高:几十种甚至上百种性质类似的化合物可在同一根色谱柱上得到分离，能解决许多其他分析方法无能为力的复杂样品分析。灵敏度高：利用高灵敏度的检测器，可以检测出10-11g～10-13g数量级物质。快速：一般而言，色谱法可在几分钟至几十分钟内完成一个复杂样品的分析。应用范围广：分析对象可以是在柱温条件下能汽化的有机或无机的试样。一般不适于沸点高于500℃的难挥发物质和热不稳定物质的分析。

皂膜流量计转子流量计调整仪，标准仪SetupofGasChromatograph二、气相色谱分析流程

一般的气相色谱仪由五部分组成：Ⅰ载气系统：气源、气体净化器、供气控制阀门和仪表。Ⅱ进样系统：进样器、汽化室。Ⅲ分离系统：色谱柱、控温柱箱。

Ⅳ检测系统：检测器、检测室。Ⅴ

记录系统：放大器、记录仪或积分仪、色谱工作站。

§11-4气相色谱固定相一、气相色谱柱填充柱：柱内径较大（2～6mm），柱内部填充固定

两类{相颗粒。

毛细管柱：内径小（0.2～0.53mm），固定相涂覆在内壁上。

气相色谱柱中固定相是影响组分分配系数的主要因素，对分离情况起着决定性作用。常用固定相有两种类型：吸附剂型固定相（气固色谱）

固定相{

担体+固定液型固定相（气液色谱）

二、气固色谱固定相一般用表面具有活性的吸附剂作固定相。常用吸附剂型固定相有：

对于气态烃类及永久性气体的分离能获得较好的效果。高分子多孔微球应用日益广泛，特别适用于有机物中痕量水分的测定。

三、气液色谱固定相由担体+固定液组成。

固定液涂渍在担体上，装填于柱中构成色谱柱。气相色谱分析法中大多数采用气液色谱法。1.担体是一种化学惰性的、多孔性的固体微粒，能提供较大的惰性表面，使固定液以液膜状态均匀地分布在其表面。常用担体有：硅藻土型（最常用）和非硅藻土型。(1)硅藻土型担体：①红色担体：（101型担体）特点是：表面空隙小、比表面积大、机械强度高、担液能力强、表面有吸附中心。②白色担体：（6201型担体）特点是：表面空隙较大、比表面积较小、机械强度较差、担液能力中、表面少吸附中心。

硅藻土型担体用前往往要预处理：酸洗、碱洗、硅烷化→以除去其表面吸附中心。（2）非硅藻土型担体：聚合氟塑料担体、玻璃微球担体、高分子微球担体等。特点是：表面空隙适中、比表面积适中、机械强度较强、耐高温、耐强腐蚀、价格偏高。

2.固定液及其选择一般是高沸点的有机化合物。

参照“相似相溶”原则选择适当固定液。

（1）固定液的极性

固定液与待测化合物之间的作用力主要属定向力、诱导力、色散力、氢键力等弱相互作用为主，所以固定相的极性对分离过程非常重要。较早，固定相极性用相对极性P表示。

规定：β,β’-氧二丙腈固定液的P=100、角鲨烷固定液的P=0、以它们为标准，其他各种固定液的相对极性在0～100之间。以20为一级分成五级：0~20

为0~+1

，称非极性固定液；20~40

为+1~+2

，称弱极性固定液；40~60为+2~+3

，称中极性固定液；80~100

为+4~+5,称强极性固定液。

后来，提出麦氏常数法。每种固定液的麦氏常数有五个，代表各种作用力。因此，以五常数的总和（各种作用力的总和）来说明一种固定液的极性。

（2）固定液的选择

依据固定液极性与待测组分极性来选择，原则为：“相似相溶原理”

§11-5气相色谱检测器

一、气相色谱检测器的类型

检测器的作用是将经色谱柱分离后的各组分按其特性及含量转换为相应的电信号E。在一定的范围内，信号的大小与进入检测器的物质的质量或浓度成正比。

E∝m或E∝c

其比例系数成为检测器的相应值或灵敏度、应答值。检测器性能应尽可能满足灵敏度高、检测限低、稳定性好、线性范围宽和响应快等要求。

检测器的类型气相色谱检测器根据响应原理的不同可分为浓度型检测器和质量型检测器两类。浓度型检测器：测量的是载气中某组分瞬间浓度的变化，即检测器的响应值和组分的瞬间浓度成正比。如热导池检测器（TCD）和电子捕获检测器（ECD）。质量型检测器：测量的是载气中某组分质量流速的变化，即检测器的响应值和单位时间进入检测器的组分质量成正比。如氢火焰离子化检测器（FID）和火焰光度检测器（FPD）。

通用检测器有：

①

热导池检测器，TCD(Thermalconductivitydetector)

测一般化合物和永久性气体

②

氢火焰离子化检测器,FID

(Hydrogenflameionizationdetector)测一般有机化合物专用检测器有：

③

电子俘获检测器，ECD(Electroncapturedetector)测带强电负性原子的有机化合物

④火焰光度检测器，FPD(Flamephotometricdetector)测含硫、含磷的有机化合物特殊检测器有：

FTIR、MS，实为仪器联用，主要用于测化合物结构。

二、重要的气相色谱检测器

1、热导检测器 原理；就是利用不同的物质具有不同的导热系数。是具有广谱性响应的检测器。Self-study：构造、原理及影响检测灵敏度的因素。

2、氢火焰离子化检测器原理：利用有机化合物在氢火焰中燃烧时能产生带电离子碎片，收集其荷电量进行测定。对大多数有机物有很高的灵敏度。Self-study:

构造，工作原理及影响检测灵敏度的因素。3、电子捕获检测器

Electroncapturedetector,ECD

高选择性，(放射源63Ni，产生β射线；N2载气，产生电子(基流)。含杂原子试样吸收电子产生负峰)；仅对含有卤素、磷、硫、氧等强电负性的元素的化合物有很高的灵敏度，检出限10-14g·mL-1。

对大多数烃类没有响应。

较多应用于农副产品、食品及环境中农药残留量的测定。ECD4、火焰光度检测器(flamephotometricdetector,FPD)

化合物中硫、磷在富氢火焰中被还原，激发后，辐射出394nm和528nm的光谱，可被检测。该检测器是对含硫、磷有机物的高选择性检测器。

§11-6气相色谱操作条件的选择

1、载气种类及流速的选择

实际工作中，为了缩短分析时间，常使流速稍高于最佳流速。

载气种类选择载气种类影响到Dg，从而与分子扩散项和传质阻力项有关。当载气流速小时，分子扩散项对柱效能的影响为主要，此时应选用摩尔质量大的气体（如N2、Ar）作载气，以抑制纵向扩散，获得较好的分离效果。当载气流速大时，传质阻力项对柱效能的影响为主要，此时应选用摩尔质量较小的气体（如H2、He）作载气，以减小传质阻力，提高柱效能。载气的选择还应考虑检测器的种类。

2、柱温的选择（影响分配系数K、分析时间和柱效能H）

能使沸点最高的组分达到分离的前提下，尽量选择较低的温度。当然被测物的保留时间要短、峰形不能有严重拖尾。一般柱温应比各组分的平均沸点低20～30℃，以实验优化选择。

沸点范围较宽的试样，宜用程序升温（见后图）。3、柱长和柱内径的选择

尽可能采用较短的柱（填充柱）；内径增加不利。4、进样量和进样时间的选择

进样量应控制在峰面积或峰高与进样量呈线性关系的范围内。以进样量适当为宜；进样速度必须快，避免起始宽度增大。5、汽化温度的选择

要求迅速汽化。适当提高汽化室温度对分离和定量有利，一般较柱温高30-70度，与试样的平均沸点相近。

一、

毛细管气相色谱的特点二、结构和流程§11-7

毛细管柱气相

色谱法简介Capillarygaschromatograph毛细管色谱柱类型涂壁开管柱（wallcoatedopen

tubular，WCOT柱）：将固定液直接涂敷在管内壁上。柱制作相对简单，但柱制备的重现性差，寿命短。后来，采用化学键合或交联柱。将固定液通过化学反应键合在管壁上或交联在一起。使柱效和柱寿命进一步提高。

多孔层开管柱（porouslayeropentubular，PLOT柱）：管壁上涂敷一层多孔性吸附剂固体微粒。构成毛细管气固色谱。

载体涂渍开管柱（supportcoatedopentubular，SCOT柱）：将非常细的担体微粒粘接在管壁上，再涂固定液。柱效较WCOT柱高。一、毛细管气相色谱的特点

1.提高色谱分离能力的途径

(1)塔板理论：增加柱长，减小柱径，即增加柱子塔板数。

(2)速率理论：减小组分在柱中的涡流扩散和传质阻力，可降低塔板高度。2.毛细管色谱柱的结构特点（1）不装填料，阻力小，长度可达百米的毛细管柱，管径0.2mm。（2）气流单途径通过柱子，消除了涡流扩散；且分析速度快，纵向扩散较小。（3）固定液直接涂在管壁上，总柱内壁面积较大，涂层很薄，则气相和液相传质阻力大大降低。（4）毛细管色谱柱柱效高达每米3000～4000块理论塔板，一支长度100m的毛细管柱，总的理论塔板数可达104～106。

3.毛细管色谱具有以下优点（1）分离效率高：比填充柱高10～100倍。较多采用程序升温方式。特别适合复杂试样的分析。（2）分析速度快：比填充柱色谱速度快。（3）色谱峰窄，峰形对称。（4）灵敏度高，一般采用氢焰检测器。二、结构流程具有分流和尾吹装置

一、高效液相色谱法的特点与应用

高效液相色谱法：流动相——液体在经典色谱法的基础上引入气相色谱的理论，技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏检测器，建立了分析速度快、分离效率高和灵敏度高的色谱方法。

（1）特点高压：150-350×105Pa

高速：1-10mL/min

高效：大于30000塔板/米高灵敏：10-9g（紫外检测）、10-11g（荧光检测）§11-8高效液相色谱法概述

（2）应用

GC：适于能气化、沸点较低、热稳定性好的样品（沸点在500℃以下，相对分子质量在400以下的有机物）；但对高沸点、热稳定性差、离子型及高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可检测。占有机物的20%（能测定）

HPLC：不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分子量大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分子和离子型样品均可检测。用途广泛，占有机物的80%二、影响色谱峰扩展及色谱分离的因素

基本概念、理论基础与气相色谱一致，如保留值、分配系数、分离度、塔板理论、速率理论等。主要差别如：

GC：流动相为惰性，组分与流动相无亲合作用力，只与固定相有相互作用。

HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改变流动相极性和pH值也对分离起到调控作用；当选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相也可以增大分离选择性（梯度洗提）。

速率理论（与GC对比）1）涡流扩散项(与GC相同)2）纵向扩散项分子在液体中的扩散系数比在气体中要小4-5个数量级，3）传质阻力项c.u是决定性因素。

传质阻力项c.u

1．贮液罐2．高压泵（输液泵）3．进样装置4．色谱柱——分离5．检测器——分析6．废液出口或组分收集器7．记录装置§11-9高效液相色谱仪

高效液相色谱仪主要部件(1)高压泵主要部件之一，压力：400×104～500×105Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相(<5μm)，液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性。(2)梯度淋洗装置高压梯度（内梯度）:

利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。低压梯度（外梯度）:

一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例混合再用高压泵输入柱中。(3)进样装置

流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，结构如图所示：

六通阀进样演示(4)色谱柱

柱体为直形不锈钢管，内径1～6mm，柱长5～40cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。(5)液相色谱检测器

a.紫外检测器应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：灵敏度高；线性范围宽；流通池可做得很小(1mm×10mm，容积8μL)；

对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。b.光电二极管阵列检测器

紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图。光电二极管阵列检测器c.示差折光检测器

（Differentialrefractiveindexdetector）

除紫外检测器之外应用最多的检测器。可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度成正比。

通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）。灵敏度低、对温度敏感，不能用于梯度洗脱。

偏转式和反射式2种。d.荧光检测器

（Fluorescencedetector）

高灵敏度，高选择性。对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。

此外，还有电导检测器、蒸发光散射检测器。一、液固吸附色谱法（LSC）二、液液分配色谱法（LLC）三、离子对色谱法（IPC）四、离子交换色谱法（IEC）五、离子色谱法（IC）六、空间排阻色谱法（SEC）

§11-10高效液相色谱法的主要分离类型

1．分离原理

固定相：固体吸附剂,如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂。

流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性。

一、液固吸附色谱法（LSC）

基本原理：

流动相中的溶质分子（X）与溶剂分子（S）在固定相吸附剂上的竞争吸附：

Xm+nSa=Xa+nSm

下标m、a分别表示流动相和固定相，n是被吸附的溶剂分子数。达到吸附平衡时，吸附平衡常数（K）可表示为：吸附平衡常数K值大，表明该溶质分子在固定相上被吸附的多，吸附作用强，该组分的保留时间长，分配系数也大。2．固定相：与GC比，固定相粒径不同（<10μm）

（2）高分子多孔小球：YSG

原理：吸附+分配蒹小孔凝胶作用特点：柱选择性好，峰形好，柱效低适用：分离弱极性化合物（1）硅胶表孔硅胶（薄壳硅胶）全多孔硅胶无定形YWG5~6μm5×104

球形YQG3~4μm8×108

原理：吸附特点：峰易拖尾适用：分离极性化合物

固定相与流动都是液体，相互不相溶。

基本原理：组分在固定相和流动相上的分配，在两相中溶解度存在差异。即K或k的差异，导致分离。

流动相：亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性(正相normalphase)，反之流动相的极性大于固定液的极性(反相reversephase)。正相与反相的出峰顺序相反。

固定相：早期涂渍固定液，现已不采用。

化学键合固定相：将基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上，如C18柱（反相柱）。二、液液分配色谱法（LLC）1．分离原理2.固定相（1）全多孔型固定相：由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体作为担体；早期采用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见（现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料）。

（2）表面多孔型固定相：（薄壳型微珠担体）

30～40μm的玻璃微球，表面附着一层厚度为1～2μm的多孔硅胶。表面积小，柱容量低。物理或机械涂渍法，固定液流失不可避免。（3）化学键合固定相：

化学键合固定相：应用最广、性能最佳的固定相。

a.硅氧碳键型：≡Si—O—Cb.硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si—

C

（稳定，耐水，耐光，耐有机溶剂，应用最广）

c.硅碳键型：≡Si—Cd.硅氮键型：≡Si—N利用化学反应将固定液的有机分子键合到担体表面化学键合相特点：表面没有液坑

不易流失，稳定性好适合于多种色谱类型及试样分析适于梯度洗脱反相键合相色谱，已成为应用最广泛的分支。分析实例：三、离子对色谱

ionpairchromatography

将一种(或多种)与溶质离子电荷相反的离子(对离子或反离子)，加到流动相中与溶质离子结合形成疏水性离子对，从而控制溶质离子的保留行为。

阴离子分离：对离子常用烷基铵类，如氢氧化十六烷基三甲铵。

阳离子分离：对离子常用烷基磺酸(己烷磺酸钠)。

反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C18柱)，含有对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+X-。基本原理：形成的离子对化合物X+Y-，在两相间进行分配：

X+水相

+Y-水相

=X+Y-有机相

平衡常数：

溶质在两相间的分配系数DX为

不同待测离子与反离子形成离子对的能力不同，分配系数存在差异，导致在固定相中滞留时间不同，从而实现色谱分离。

离子对的容量因子k可表示为：则组分的保留时间：tR=tM(1+k)

保留值随KXY和[Y-]水相的增大而延长，而KXY取决于对离子和有机相的性质，则控制流动相中加入的对离子特性和浓度可以调整组分保留时间，达到提高色谱分离选择性的目的。分析实例：四、离子交换色谱

固定相：阴离子交换树脂或阳离子交换树脂。

流动相：阳离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液，可分离各种阳离子混合物；阴离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液，可分离各种阴离子混合物

。

离子交换基本原理

组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长。

阳离子交换：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+

阴离子交换：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-平衡时，平衡常数为

对于磺酸型阳离子交换树脂，一价阳离子的KB/A值顺序：

Cs+>Rb+>K+>NH4+>Na+>H+>Li+二价阳离子的KB/A值顺序：

Ba2+>Pb2+>Sr2+>Ca2+>Cd2+>Cu2+对于季铵型阴离子交换树脂，一价阴离子的KB/A值顺序：

ClO4->I->HSO4->SCN->NO3->Br->NO2->CN->Cl->BrO3->OH->HCO3->H2PO4->IO3->CH3COO->F-离子交换色谱分离固定相

结构类别：（1）薄壳型离子交换树脂薄壳玻璃珠为担体，表面涂约1%的离子交换树脂。（2）离子交换键合固定相薄壳键合型；微粒硅胶键合型（键合离子交换基团）。树脂类别：（1）阳离子交换树脂（强酸性、弱酸性）。（2）阴离子交换树脂（强碱性、弱碱性）。离子交换分离实例五、离子色谱法(IonChromatography，简称IC)

在离子交换色谱法的基础上，于20世纪70年代出现、80年代迅速发展起来的液相色谱法，并快速发展成为水溶液中阴离子分析的最佳方法。

其基本思路是：离子交换柱交换离子，电解质溶液洗脱，用电导检测器检测。但电解质背景离子对电导检测器有干扰，设置抑制柱。典型的为双柱型离子色谱仪。离子色谱仪非抑制型:

当进一步降低分离柱中树脂的交换容量(0.007～0.07mmol/g干树脂),使用低浓度、低电离度的有机弱酸及弱酸盐作淋洗液，如苯甲酸、苯甲酸盐等。检测器可直接与分离柱相连，不需抑制柱。五、空间排阻色谱法

（stericexclusionchromatography）

固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；

原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。相对分子质量在100～105范围内的化合物按质量分离。

空间排阻色谱固定相（1）软质凝胶葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构。水为流动相。适用于常压排阻分离。（2）半硬质凝胶苯乙烯