地龙2号对大鼠肝纤维化形成的影响

地龙2号对大鼠肝纤维化形成的影响

肝纤维是由肝脏中的纤维生成的，即使它超过了分解的分解，肝实质（ecm）也会被肝脏过度积聚引起的中心环节。肝脏星状细胞（hec）的激活是肝纤维形成的中心环节。根据许多研究，参与ecm的还有原始酶和纤溶酶的分解。地龙2号是采用独特的生物工程技术从地龙中提取的含有多种有效活性成分,其主要成分是蚯蚓纤溶酶及蚯蚓胶原酶。我们已研究发现地龙2号可以抑制大鼠肝内纤维组织的形成,减轻肝细胞的损害,明显降低血中透明质酸和层黏连蛋白。本研究旨在探讨在大鼠肝纤维化形成过程中地龙2号对肝内纤维组织的形成与α_SMA、TGF_β1、MMP_13及TIMP_1蛋白表达的影响。材料和方法一、动物雄性Wistar大鼠52只,体重160±10g,购自河南医科大学实验动物中心。二、地龙2号生命科学研究进展CCl4(上海四星医药科技工贸公司出品);精制花生油(山东鲁花集团产品);秋水仙碱(昆明制药有限公司产品),1mg/片;地龙2号由南京农业大学生命科学院张治国教授惠赠。后两药临用前用单蒸水稀释。兔抗大鼠α_SMA多克隆抗体、兔抗大鼠TGF_β1多克隆抗体、兔抗大鼠MMP_13多克隆抗体及兔抗大鼠TIMP_1多克隆抗体均购自武汉博士德生物工程有限公司,即用型SP免疫组化试剂盒购自福州迈新试剂公司,DAB购自北京中山生物公司。三、药物处理组雄性Wistar大鼠52只,随机分成6组。模型组(M组,10只):将CCl4与花生油以4∶6配成40%油剂,按每100g体重0.2ml(首剂CCl4与花生油以3∶1配成75%油剂,按每100g体重0.3ml),皮下注射,2次/周,单蒸水灌胃,10ml·kg-1·d-1。阳性对照组(PC组,10只):CCl4造模的同时,用秋水仙碱灌胃,0.1mg·kg-1·d-1。地龙2号大剂量组(Eh组,10只):CCl4造模的同时,用地龙2号灌胃50mg·kg-1·d-1。地龙2号小剂量组(E1组,10只):CCl4的造模同时用地龙2号灌胃,25mg·kg-1·d-1。正常组(N组,6只):不做药物处理。阴性对照组(NC组,6只):皮下注射花生油,单蒸水灌胃,10ml·kg-1·d-1。所有药物均现配现用,每只大鼠用药前均称体重。四、单次给药对羊抗兔抗体的抑制作用用药过程中大鼠死亡数为M组1只,PC组2只,Eh组3只。存活大鼠均于第8周末处死,取同一部位切除的肝脏于10%中性缓冲福尔马林液中固定、酒精梯度脱水、石蜡包埋、切片,厚度为4μm经常规脱蜡脱水,3%H2O2去除内源性过氧化物酶,0.1mol/L枸椽酸盐缓冲液微波处理,马血清封闭非特异性抗原,分别滴加兔抗大鼠多克隆抗体α_SMA(1∶150)、TGF_β1(1∶100)、MMP_13(1∶100)及TIMP_1(1∶150),4℃过夜,阴性片以PBS代替一抗,后依次加入羊抗兔抗体IgG,辣根酶标记的链霉卵白素工作液进行反应,用DAB显色、脱水、透明,中性树胶封片,分别检测组织中α_SMA、TGF_β1、MMP_13及TIMP_1的表达情况,阳性片细胞胞浆中出现棕黄色,阴性片无着色。五、显色范围及其划分参照免疫组化显色标准略修改:按显色程度分弱、中、强3种,分别用+、++、+++表示。每个标本每个指标,取5个较好的高倍视野,按显色范围分为:①+:显色范围占高倍视野<1/4;②++:显色占高倍视野1/4～2/4;③+++:显色占高倍视野2/4～3/4;④++++:显色占高倍视野>3/4。并将每个高倍视野显色程度和范围换算成“显色指数”,显色指数=显色程度×显色范围(+为1、++为2、+++为3、++++为4),取其均数为每个检测指标的最终显色指数。六、均数和均数计算用SPSS10.0软件包统计分析,计量资料以x¯±sx¯±s表示,多组间均数两两比较用单因素方差分析,LSD法。用Spearman法进行相关性检验。结果一、eh和点分布N及NC组可见血管壁少量α_SMA阳性表达;M组α_SMA阳性表达细胞数明显增多,胞浆呈棕黄色,有的细胞有2～3个较长突起,主要分布于门静脉、汇管区、纤维间隔和邻近的肝窦;Eh及E1组汇管区、纤维间隔和邻近的肝窦阳性细胞数目显著减少,胞浆阳性染色显著减轻,P<0.01;PC组与M组相比,α_SMA表达的显色指数无显著性差异(见附表,图1～2)。二、细胞密度对肝胰腺组织病理学染色深的影响N及NC组TGF_β1未见表达;M组TGF_β1在汇管区和纤维隔中染色明显加深,主要见于肝脏星状细胞和炎性细胞浆中,呈染色较深的棕黄色;Eh及E1组在纤维隔内间质细胞和炎细胞胞浆阳性染色程度减轻,阳性细胞数目减少,P<0.01;PC组与M组相比,TGF_β1表达的显色指数无显著性差异(见附表,图3～4)。三、mmp13的表达N及NC组MMP_13在汇管区的血管壁和胆管壁周围有阳性染色。M组阳性染色多集中于纤维间隔、中央静脉周围、肝窦处的间质细胞胞浆棕黄色着色明显可见,而在Eh及E1组,尤以纤维间隔及肝窦处的间质细胞胞浆棕黄色着色明显增多,与M组相比,MMP_13的表达显著升高,显色指数前者P<0.05,后者P<0.01(见附表,图5～6)。四、各组小鼠性染色表达部位的比较TIMP_1在N及NC组汇管区的血管壁和胆管壁周围有少量阳性染色。M组TIMP_1阳性染色表达部位和MMP_13组一致,与N及NC组相比具有显著的统计学差异。Eh及E1组仅见汇管区和纤维间隔中有少量较淡的阳性染色,与M组相比表达明显下降,显色指数P<0.01。PC组TIMP_1的表达显色指数与M组相比无统计学意义(见附表,图7～8)。sma的表达免疫组化对TGF_β1、α_SMA、MMP_13、TIMP_1蛋白表达的研究表明:正常组上述指标的表达较少甚至不表达,用CCl4造模8周后,M组的TGF_β1、α_SMA在汇管区和纤维间隔中染色明显加深,α_SMA是HSC激活的标志。激活的HSC分泌多种细胞因子,其中TGF_β1是最强的致纤维化因子,具有抑制肝细胞增殖、诱导肝细胞凋亡,激活HSC、促进其产生细胞外基质、减少细胞外基质降解的作用。应用地龙2号后α_SMA与TGF_β1的表达显著降低,与肝纤维化程度下降也呈明显的正相关(Eh组前者r=0.832,P=0.020,后者r=0.77,P=0.043;E1组前者r=0.715,P=0.020,后者r=0.785,P=0.007),且在M、Eh、E1组α_SMA与TGF_β1的蛋白表达均呈明显的正相关,其作用机制可能是地龙2号可使α_SMA表达下降,提示其可能抑制了HSC的活化,TGF_β1的分泌减少,从而使致肝纤维化因子释放减少,ECM合成下降,减轻肝纤维化的程度。MMP_13或胶原酶3,属于中性蛋白酶一族,需锌离子的激活,专门降解Ⅰ、Ⅲ型间质胶原酶,胶原酶活性的正常调控受到破坏可促进肝纤维化的进展,而造成肝纤维化、肝硬化形成的主要原因之一是特异性降解Ⅰ、Ⅲ型胶原的间质胶原酶在纤维化进展期活性下降所致。TIMP_1则为MMP_13的抑制物。MMP_13与TIMP_1在肝纤维形成过程中主要由激活的HSC分泌。IredaleJP等认为肝纤维化过程中TIMP_1与MMP_13动态平衡破坏即前者升高后者降低的结果是促进了胶原纤维的累积并促进肝纤维化的发展,我们发现TIMP_1在M组于纤维间隔、中央静脉周围、肝窦处的间质细胞胞浆可见大量棕黄色着色,MMP_13亦可见表达,应用地龙2号后,TIMP_1表达明显减少,而MMP_13表达则升高显著。M组肝纤维化程度与TIMP_1蛋白表达升高呈正相关,r=0.952,P=0.000,而与MMP_13蛋白表达无相关性;Eh组肝纤维化程度与MMP_13、TIMP_1蛋白表达无相关性,E1组肝纤维化程度与TIMP_1、MMP_13蛋白表达均呈正相关性,分别为r=0.929,P=0.000;r=0.699,P=0.025,具有显著的统计学意义。由此可见,CCl4造模诱导肝纤维化8周末,TIMP的蛋白表达显著升高,而MMP_13的升高不明显,MMP_13/TIMP_1的不平衡表达,可能是肝纤维化形成的主要原因。而同时给予地龙2号后,MMP_13则显著升高,TIMP_1则明显降低,说明地龙2号尤其是小剂量者可以逆转该不平衡,促进过多ECM的降解,这可能与地龙2号本身所含有的蚯蚓胶原酶能够直接降解间质胶原有关,另外,地龙2号亦含有蚯蚓纤溶酶,而纤溶酶能有效激活MMP_1(胶原酶_1)和MMP_3(间质溶素_1),对ECM亦具有分解作用,因此,地龙2号是否对MMP_13有激活作用尚未知,但我们认为不能排除这种可能性。对M组、Eh组及E1组α_SMA、TGF_β1、MMP_13及TIMP_1四者之间蛋白表达