第1、2章 食品生物技术概论、基因工程及其在食品工业中的应用

第一章食品生物技术概论Introductionto

FoodBiotechnology

现代生物技术是70年代未80年代初以现代生物学研究成果为基础，以基因工程为核心发展起来的一门新兴学科。现已成为解决人类面临的人口、资源、能源、食物和环境等五大危机的主要途径之一。

食品生物技术是生物技术在食品原料生产、加工和制造中的应用的一个学科。它包括了食品发酵和酿造等最古老的生物技术加工过程，也包括了应用现代生物技术来改良食品原料的加工品质的基因、生产高质量的农产品、制造食品添加剂、植物和动物细胞的培养以及与食品加工和制造相关的其他生物技术，如酶工程、蛋白质工程和细胞工程等。生物技术概述食品生物技术概述克隆羊多莉转基因延熟番茄人类对自然界的要求

认识——利用——再造——改造——创造

现代生物学技术的发展也为科学研究提出了新的研究思路和方法。传统生物技术是根据生物的性状，找到有关的蛋白质，再确定其基因；现在可以先分离特定蛋白推测其基因或直接分离其基因，经克隆测序、表达，再研究其功能。这一过程与传统生物学相反，故称反向生物学。

随着反向生物学的问世,在20世纪八十年代诞生了生物技术(Biotechnology)这门新学科。

生物技术学科的地位

世界新技术革命的主角之一,

生物技术与新材料,信息技术(包括微电子、计算机)一起已成为新产业革命三大支柱之一；

阳光技术，朝阳产业，黄金工程，倍受世界各国重视。生物技术将成为21世纪高技术革命的核心内容。生物技术的重要性

有助于解决全球的重大难题：资源（能源）、人口、粮食、生态环境、健康与疾病和战争与灾害；促进传统产业的技术改造和新产业的形成，对人类社会生活产生深远的革命性影响；生物技术这一新生事物正迅速走向老百性日常生活各个方面,将对人类的发展做出贡献。一、生物技术的定义及内涵生物工程，一般称为生物技术(Biotechnology,BT),是以生命科学为基础，结合其他科学如工程学的原理和工程技术，利用生物（或生物组织、细胞及其他组成部分）的特性和功能，设计、构建具有预期性能的新物质或新品系，进而加工生产产品或提供服务的综合性技术。

简而言之，生物技术是应用生命科学的研究成果，以人们的意志对生物或生物的成分进行改造和利用的技术。

1、定义现代生物技术代表着高新技术，但至今还没有一个统一的定义。而从学术方面对生物技术下定义是在20世纪的事（一）Biotechnology术语的诞生

1919年一位匈牙利农业经济学家KarlEreky首创了“Biotechnology”一词目的：表达一切用生物转化手段进行生产的概念，并表明生物学与技术之间的内在联系（二）国际纯粹及应用化学联合会的定义（1982）生物技术是将生物化学、生物学、微生物学和化学工程应用于工业生产过程及环境保护的技术。

（三）国际经济合作及发展组织的定义（1982）

生物技术是应用自然科学和工程学的原理，依靠生物催化剂(酶或活细胞)的作用对物料进行加工，以提供产品为社会服务的技术（四）1985年Moo-Young主编的《综合生物技术》中的定义生物技术是对生物作用和生物物料加以评价和应用，并进行工业产品生产的技术

综合各种有关定义的基本内容，可以认为生物技术有以下3个特点：

生物技术是一门多学科、综合性的科学技术反应中需有生物催化剂（酶、菌或细胞）的参与其最后目的都是要建立物质生产过程或进行社会服务二、生物技术的范畴目前我国学术界一般认为，构成生物技术主题的主要包括4大先进技术：基因工程细胞工程酶工程发酵工程二、生物技术的范畴重点研究功能性蛋白和肽类、多糖和寡糖、功能性脂肪和脂肪酸等重要生理活性食品的生物加工技术，以全面提升食品的营养、质量和安全性。为了生产某种产品，往往需要综合利用4种或其中某几种，因此四者彼此密切联系、难以分割，但其中最重要的当属基因工程和发酵工程。生物技术的发展前景（一）生物制药领域会有大突破人生长激素抑制素基因、微生物杀虫剂、杀菌剂（二）农业和食品加工业大发展1、生物技术提高粮食产量品质2、生物技术改进食品品质和加工工艺3、抗性基因工程育种4、花卉基因工程5、畜牧生物技术生物技术的发展前景（三）能源和环境生物技术大有可为能源：生物能源环境：生物传感器、微生物降解技术、生态环境生物防治、生物修复技术、生物农药第二节食品生物技术一、定义生物技术可用以改良食品的营养价值、风味，去除食品不良特性、延长食品储存期，节省能源，降低食品加工过程对环境的不利影响。食品生物技术是生物技术的重要分支，主要是指生物技术在食品工业中的应用。食品生物技术的任务研究生物技术在食品原料生产、加工制造和质量控制中的应用。包括食品发酵和酿造等古老的生物技术加工过程，也包括应用现代生物技术来改良食品原料的加工品质的基因、生产高质量的农产品、制造食品添加剂、植物和动物细胞的培养以及与食品加工相关的其他技术，如酶工程、蛋白质工程和酶分子的进化工程。食品生物技术的范畴（一）食品基因工程以分子遗传学为基础，以DNA重组技术为手段，实现动植物、微生物等种间的基因转移或DNA重组，达到食品原料或食品微生物的改良。或者在此基础上，采用DNA分子克隆，对蛋白质分子进行定位突变的所谓蛋白质工程。食品生物技术的范畴（二）食品细胞工程利用细胞生物学方法，按照人们预定的设计，有计划地改造遗传物质和细胞培养技术，包括细胞融合技术以及动植物大量控制性培养技术，以生产各种保健食品有效成分、新型食品和食品添加剂。食品生物技术的范畴（三）食品酶工程在食品工业中开发利用酶，包括把游离酶或（含酶）细胞进行固定化处理，以便更好地应用于食品生产过程中物质的转化。食品生物技术的范畴（四）食品发酵工程采用现代发酵设备，使经优选的细胞或经现代技术改造的菌株进行放大培养和控制性发酵，获得工业化生产预定的食品或食品的功能成分。如：高产干酪凝乳酶的大肠杆菌基因工程菌优良的面包酵母基因工程菌食品生物技术的研究与应用领域（一）研究领域涉及基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程及其相关的全部生物技术领域。主要集中在动植物性食品资源的种质改造，食品酶制剂、发酵性食品及生物源功能性食品添加剂等生产菌种的改良，食品分析和安全检测等领域。食品生物技术的研究与应用领域（二）应用领域基因工程领域细胞工程领域酶工程领域发酵工程领域。食品生物技术的发展前景（1）转基因食品进一步发展（2）新资源食品层出不穷（3）微生物保健食品快速发展（4）利用生物技术生产的食品添加剂新品种不断涌现。食品生物技术的研究内容生物技术与食品安全检测常规化学检测不能满足快速判定的需要，近年来，生物技术检测方法因其特异的生物识别功能、极高的选择性，精确、灵敏、快速、成本低廉，尤其在检测致病性微生物、转基因食品等方面不可或缺。用于食品检测常用几种生物技术：（一）核酸杂交（二）PCR（三）生物芯片（四）生物传感器。食品生物技术的研究内容（七）生物技术与食品工业“三废”治理食品工业排放的废水量非常大食品工业的原料广泛，产品种类繁多，排出的废水水质、水量差异很大废水中主要污染物：漂浮的废水固体物质：茶叶、肉、骨碎屑、动物内脏和排泄物植物废渣、皮。悬浮在废水中的油脂、蛋白质、淀粉、血水、酒糟、胶体物溶解在废水中的糖、酸、盐类食品生物技术的研究内容（七）生物技术与食品工业“三废”治理来自原料夹带的泥沙、动物粪便致病菌主要特点：有机物质和悬浮物含量高，易腐败，一般无毒性常用食品工业废水处理方法：物理法化学法物理化学法生物处理法食品生物技术的研究内容（七）生物技术与食品工业“三废”治理食品生物技术的研究内容（七）生物技术与食品工业“三废”治理（八）食品生物技术的其他应用（一）生物防治保鲜生物防治用于保鲜的特点：无污染、药物残留、无抗药性，储藏条件以控制，处理费用低。菠萝——青霉菌，降低腐烂率草莓——霉菌，降低灰霉病的发病率苹果——细菌，防止斑烂（八）食品生物技术的其他应用（二）遗传工程保鲜例1：乙烯：植物激素，促进水果的成熟。关闭产生乙烯的基因延缓果实的成熟。例2：基因操作，控制后熟油桃——延迟脱落和着色久藏不坏。食品生物技术的特点和研究方向一、食品生物技术的基本特征（一）食品生产模式发生“绿色转移”农业工业化：农工业、工农业利用转基因动植物生产各种工业产品：促红细胞生成素、疫苗等食品生物技术的特点和研究方向一、食品生物技术的基本特征（二）食品加工“重心前移”由生产后——生产前移甚至整个生产过程向更有利于保证食品安全与质量的方向迁移（三）“食品安全”的内涵发生变化传统的食品安全：无毒+卫生变化：转基因食品的安全问题。开发分析检测技术检测转基因食品食品生物技术的研究方向1、利用基因工程、细胞工程技术对食品资源进行改造与改良2、利用发酵工程、酶工程技术将农副原材料加工成商品。如发酵制品3、利用生物技术对产品进行二次开发，形成新的产品4、利用酶工艺、发酵技术、生物反应器等对传统食品加工工艺进行改造，降低能耗、提高产率、改善品质。二、食品生物技术的定义：

是现代生物技术在食品领域中的应用。是以现代生命科学的研究成果为基础，结合现代工程技术手段和其他学科的研究成果，用全新的方法和手段设计新型的食品和食品原料。三、食品生物技术在食品工业发展中的地位和作用利用基因工程技术设计新型食品及食品原料发酵技术应用于食品生产以及食品添加剂的生产。酶在食品中应用广泛生物工程下游技术是食品形成产品的必须手段转基因番茄/普通番茄SOLID-STATEFERMENTATIONPRODUCTION抗生素、生物制药、氨基酸、核苷酸、有机酸、饲料添加剂、微生态制剂、生物农药、生物肥料等基因工程药物、疫苗及抗体产品加强遗传育种研究，加强基因改造生物为主的应用研究，培育更适合食品加工的优良品种，开发现代生物技术新产品。提取番茄红素用的番茄品种。食品工业用新酶种开发。纤维素酶、木聚糖酶等。酶或细胞的固定化技术和酶催化反应装置的结构优化等。果葡糖浆的生产。继续名优白酒传统酿造技术的改造。酒类呈香成分的剖析和主体香气成分确定、名优白酒微量成分与风味关系的解析等。四、我国应重点开发的食品生物技术五、食品生物技术的研究内容①通过基因工程和细胞工程改善食品原料农产品的品质和提高产量②利用基因工程、发酵工程生产用于农产品保鲜的“绿色”抗氧化剂、防腐剂等③通过基因工程、发酵工程、酶工程、蛋白质工程和分子进化工程使食品加工工艺高效化，提高食品的附加值，提高农产品的利用率，以及提高食品的保健功能④利用基因工程、酶工程和发酵工程减少食品的损失、提高食品质量管理的效率和保证食品质量和安全性⑤通过发酵工程和酶工程处理废弃物，提高资源的利用率并减少环境污染六、现代食品生物技术的作用主要表现在两方面：（一）现代食品生物技术对人类健康和营养的影响营养水平；健康水平；提高水果和蔬菜的货架期；预防疾病；增加农产品的附加值等（二）现代食品生物技术对经济发展和环境的影响缓解粮食短缺问题；提高农产品质量和产量；改进作物抗逆性特性；增加农产品的附加值，促进经济发展；污水处理，改善环境等食品生物技术对人类的作用可以归结为：

（1）解决食品短缺，缓解由于人口增长带来的压力；（2）丰富食品种类，满足不同层次消费人群的需求；（3）开发新型功能性食品，保障人类健康；（4）生产环保型食品，保护环境；（5）开发新资源食品，拓宽人类食物来源。七、食品生物技术的发展趋势食品生物技术食品添加剂新品种微生物保健食品螺旋藻类藻类食品虫类高蛋白食品病原菌的检测食品安全检测农副产品深加工推动食品工业可持续发展食品组分改性及加工转基因食品什么是转基因生物(GMO)?就是将某一个原生的物种，以人工的方法，转殖接入其它物种的基因，或者是将该物种的基因做修饰改造后，所产生的新的物种。这个新物种就具备新的基因型，也因此会有新的性状。转基因食品？就是以基因改造生物本身作为食品，或者是成份中含有基因改造生物的食品。一个物种的某一种性状通常是因为它具备了某个（些）基因，而因为这个基因表现，合成这个基因工的蛋白质，再由这个蛋白质来具体呈现该性状。目前主要的转基因食品有哪些？

世界上哪一个国家生产最多？

根据统计，基因改造大豆、玉米、油菜、棉花是目前全球的四大基因改造作物。美国是生产基因改造作物最多的国家，基因改造作物已是近年来的种植主流。此外，加拿大、阿根廷、巴西、中国、印度、南非、西班牙、澳洲等国家也种植基因改造农作物。

2010美国依然是世界上最大的转基因作物种植国家，去年共使用6680万公顷土地种植大豆、玉米、棉花、油菜籽、菜瓜、木瓜、苜蓿和甜菜。巴西则居第二位，在2540万公顷土地上大量种植转基因大豆、玉米和棉花，去年的种植面积比2009年增加了19%。

基因食品的类型抗逆境型：耐除草剂、抗逆境、抗虫害控熟型：使作物熟期提前或延迟，错开盛产期。营养型：转入作物中所缺乏的营养素产生基因，而生产高营养价值的作物，以避免营养素缺乏症。如黄金米。保健型:转入病体抗原基因或毒素基因至粮食作物或果树中，借由植物的摄取而获得疫苗。由将预防疾病（动脉硬化或骨质疏松症）的食物理成分相关基因转入植物，以获得保健上的功效。例如，无咖啡因茶和咖啡。新品种：利用基因重组技术形成新品种，改善原产品的品质、质地、风味等，以适应或开拓市场。加工型：为从事食品加工是所需的而研发的基因改造食品。增产型：转入与产量相关的基因。转基因食品有以下优点：增强农作物的抵抗力如对虫害的抵抗力，从而减少使用杀虫剂（防虫）。占美国玉米产量三分之二的抗虫玉米，可使一年的玉米产量增加一千万吨。适应恶劣环境使农作物更能适应不利的生长环境，如干旱（抗旱）、含高盐分土壤或特别湿润的环境。例如，改变作物的亚麻油酸含量，使其可以忍受低温及霜害。转基因食品有以下优点：增加农作物的产量全球自1996年2010年为止，基因改造作物栽培面积已经从170万公頃，迅速窜升到1.48亿公頃，增加87倍。根据联合国世界粮农组织统计，2030年世界人口将由03年60亿人增加到81亿人，其中8亿1500万人可能将处于饥饿状态。2010年全球转基因作物的种植面积比上一年增加10%.改良农作物的营养状态增加稻米的蛋白质含量，或是降低作中的脂肪含量等等。至于维生素A、碘和锌等世界性营养缺乏的问题，更可能经由基因重组的技术，使作物成为营养强化的自然食品。转基因食品有以下优点：改良食品的外观、味道和口感经基因重组技术改良过的番茄，可以延缓成熟，使采收到的运送到市场的时间可以延长，而消费者在拿到产品的有最佳的色泽和香味。

改良农作物的特性使其易于加工，减少浪费和降低生产成本，如经基因重组技术改良过的马铃薯，淀粉含量较高，油炸时吸油量较少。除去食物中某些可引致过敏的成分转基因生物的缺点：可能对昆虫造成伤害可能影响周边植物的生长可能在昆虫或病菌在演化中增加抵抗力或产生新的物种之后一样有可能会伤害作物。一些转基因作物的例子：一种北极鱼的基因产物（蛋白质）有防冻的功能，将其分离抽出，转入番茄内，育成耐寒番茄。利用植物生产人类血清蛋白。第二章基因工程及其在食品工业中的应用现代生物技术定义：以现代生命科学为基础,把生物体系与工程学技术有机结合在一起，按照预先的设计，定向地在不同水平上改造生物遗传性状或加工生物原料,产生对人类有用的新产品(或达到某种目的)之综合性科学技术。二、食品生物技术的定义：

是现代生物技术在食品领域中的应用。是以现代生命科学的研究成果为基础，结合现代工程技术手段和其他学科的研究成果，用全新的方法和手段设计新型的食品和食品原料。本章，我们讨论4个问题：1.什么是基因工程——基因工程的概念。2.为什么能进行基因工程——基因工程的原理和技术。（包括3大理论和3大技术准备）3.怎样进行基因工程——3大步骤（DNA体外重组，重组DNA导入宿主细胞后扩增和表达，基因工程后处理）4.基因工程的应用和前景——对于食品学来说即生产基因工程产品等。第一节基因与基因工程异想天开一、孟德尔遗传因子与基因1.孟德尔生平简介1822年7月22日生于奥地利莫拉维亚省的海因岑多夫村一个贫苦农民家庭；1828年，6岁的孟德尔开始接受系统的小学和中学教育；1840年，以优异的成绩高中毕业，进入厄尔姆兹哲学学院进行了两年的大学预科学习；1843年秋，进入布隆市的奥古斯汀基督教修道院当一名修道士，取教名格里高，时年21岁；1847年，被任命为神父；1849年，被委派到中学任希腊文和数学代课教师；1851年，在修道院的资助下，进入维也纳大学深造；1854年夏天，大学毕业，回到奥古斯汀修道院，开始了人生的新篇章；1856年，开始长达8年之久的豌豆杂交实验；（修道院后花园）1865年，在布隆市自然科学研究协会的年会上，公布了他的研究结果和理论解释；1866年，发表著名论文《植物杂交实验》，首次提出了遗传因子、显性性状和隐性性状等遗传学概念；1868年，当选奥古斯汀修道院院长，此后再也无力从事研究；1884年1月6日去世！2.豌豆的生物学特性后人在分析孟德尔成功发现遗传第一定律和第二定律的原因时，一致认为选择豌豆为实验材料具有决定性的意义。那么豌豆具有什么样的生物学特性呢？⑴不同的豌豆品系之间，通常存在着差异明显、易于区别而又稳定遗传的相对性状特征；（开紫花的豌豆植株）⑵豌豆花的结构比较特殊，具有雄配子的花药和具有雌配子的胚珠是由花瓣包裹着。因此它是一种严格的自花授粉植物；（豌豆花的结构）⑶豌豆具有较大型的花器官（即生殖器官），便于去雄，进行人工授粉实验。（豌豆人工授粉）3.孟德尔的单因子豌豆杂交实验－－遗传因子分离定律1856年至1863年，孟德尔在奥古斯汀修道院的后花园进行了长达8年的豌豆杂交实验。他首先选择了七对区别分明而又能稳定遗传的性状作仔细的观察。这七对性状是：花着生的部位……腋生和顶生种子的形状……圆形和皱形种子内部颜色……黄色和绿色花朵的颜色……紫色和白色植株茎杆长度……长茎和短茎成熟豆荚外形……饱满和节缩未成熟豆荚颜色……绿色和黄色

孟德尔选择具有一种相对性状，例如圆形种子和皱形种子的两个豌豆品系植株进行杂交实验。我们称这种只涉及一对性状的杂交实验为单因子杂交实验。孟德尔观察到，不论何者为父本，何者为母本，杂交得到的数百粒杂交子一代（F1）的种子，全部都是具有圆形的性状特征。第二年，他种了253粒F1代圆形种子，并让其自交，结果在得到的7324粒子二代（F2）种子中，有5474粒是圆形的，1850粒是皱形的种子，两者的比例为2.96:1，极为接近3:1。下表例举了孟德尔当年进行的7对单因子豌豆杂交实验的结果。从中可以看到在所有的显、隐性杂交实验组合中，所产生的子二代植株中，具显性性状的植株与隐性性状植株的比例，总是稳定地接近3:1这样严格简单的整数比。后来人们称这种比例为孟德尔3:1单因子杂交比例。显性性状――在杂交子一代（F1）中表现出来的性状（例如紫花对白花而言），为显性性状。隐性性状――在杂交子一代（F1）中没有表现出来的性状（例如白花对紫花而言），为隐性性状。4.孟德尔单因子杂交实验的理论解释－－遗传因子假说为了解释一对显隐性性状在杂交子二代有规律的分离现象，孟德尔提出了遗传因子假说：a.

生物个体的所有性状都是由遗传因子控制的；b.

遗传因子有显性和隐性之分，决定一对相对性状的显性因子和隐性因子，叫作等位因子；孟德尔用大写的英文字母代表显性因子，用小写字母代表相应的隐性因子；c.

在体细胞中，遗传因子是成对存在的，其中一个来自父本，一个来自母本；d.

在形成配子时，成对的遗传因子彼此分开，因此在性细胞中，它们则是成单存在的；e.

在杂交子一代（F1）细胞中，成对的遗传因子各自独立，彼此保持纯一的状态；f.

由杂种形成的不同类型的配子数目相等；g.

雌雄配子的结合是随机，有同等的结合机会。开紫花与开白花豌豆纯系植株的单因子杂交图释5.孟德尔双因子豌豆杂交实验－－遗传因子的自由组合定律在孟德尔的豌豆杂交实验中，还进行了同时具有两对显隐性相关性状的2个豌豆品系的杂交实验，我们称这种涉及2对等位因子的杂交，为双因子杂交。将产生黄色圆形种子的豌豆品系，同产生绿色皱形种子的豌豆品系进行杂交。结果发现，无论何者为父本，何者为母本，产生的子一代（F1）的种子全是黄色圆形的；同时孟德尔还选用产生黄色皱形种子的豌豆品系，同产生绿色圆形种子的豌豆品系杂交。结果发现，无论何者为父本，何者为母本，所产生的杂种子一代也全是黄色圆形的。这说明就种子颜色这一对性状而言，黄色是显性，绿色是隐性；而就种子性状这一对性状而言，圆形是显性，皱形是隐性。孟德尔注意到，由具黄圆表型的杂种子一代（F1）植株自交产生的总数556粒的子二代（F2）种子中，不但存在两种亲代表型，而且还出现了两种新表型。其中黄圆种子315粒，黄皱种子101粒，绿圆种子108粒，绿皱种子32粒。这4种表型的比例接近9:3:3:1。根据上述实验结果，孟德尔推想：由两对等位因子杂交产生的杂种F1代植株，在形成配子过程中，两对等位因子的分离是彼此独立互不相关的，而在形成合子的过程中，不同因子之间又是自由组合的。这就是所谓的遗传因子独立分配律，或叫自由组合律，亦即是孟德尔第二定律。孟德尔还进行了多因子豌豆杂交实验，其结果虽然比较复杂，但它同样遵循遗传因子的独立分离和自由组合的原则。遗传因子的自由组合定律：6.孟德尔遗传定律的再发现令人遗憾的是，孟德尔的科学发现和学术见解，并没有引起同时代科学界的重视。在他的生前，既没有受到些许的学术褒奖，也没有获得任何荣誉头衔。然而他坚信自己的科学发现终有一天会得到社会的公认，并预言“我的时代一定会到来”。果不其然，孟德尔学说在湮没了三十五年之后，即1900年被荷兰的德弗里斯、德国的科伦斯和奥地利的切尔马克等植物学家重新发现。有趣的是，这三位异国同行虽互不相识，却不约而同地，各自独立地以豌豆为材料，做了一些与孟德尔相似的实验，得出了与孟德尔相似的结论，重新发现了孟德尔的遗传定律。

孟德尔遗传因子被正式定名为基因

1909年，丹麦的一位生物学家约翰逊，根据希腊文“给予生命之义”创造了“基因”这个名词，用来代替孟德尔的“遗传因子”。但是需要指出，约翰逊当时所说的基因，并不代表遗传物质实体，只是一种与细胞的任何可见的形态结果均无关系的抽象单位，也就是遗传性状符号！7.孟德尔的主要学术贡献第一，提出了遗传因子概念，即现代的基因概念。在孟德尔当时的年代，学术界流行着“融合遗传”观点，认为决定不同亲本性状的遗传物质，在杂种后代会被彼此融合以致逐渐消失。孟德尔冲破这些思维框框，提出“颗粒遗传”思想，在大量实验事实的基础上，经过严格的统计学分析和缜密的逻辑推理，证明遗传性状是由一种独立存在的颗粒性的遗传因子决定的。第二，发现了两条遗传学基本定律，即遗传因子分离定律和自由组合定律。孟德尔认为在合子及由其发育形成的个体中，来自不同亲本的等位因子并不融合，它们在个体产生配子过程中，会彼此分开，分别进入不同的配子中去；来自不同亲本的非等位因子之间也没有融合，而是可以独立分配自由组合。孟德尔的科学发现为现代遗传学奠定了基础，后人为缅怀孟德尔的历史功绩，称这些定律为孟德尔定律，尊称孟德尔为现代遗传学之父。二、摩尔根的基因论1.摩尔根生平简介1866年9月25日，ThomasHantMorgan出生于美国肯塔基州的列克星敦市的一个富裕家庭。1880年，14岁的少年摩尔根考入肯塔基州立学院预科班学习，两年后转入本科。1886年，以全班第一名成绩从肯塔基州立学院毕业，进入约翰.霍普金斯大学从事实验胚胎学研究；1890年，在约翰.霍普金斯大学获理学博士学位；1891～1903年，在布林莫尔女子学院任教，同时在其它一些研究机构从事胚胎学方面的研究；1904～1928年，担任哥伦比亚大学动物学教授，进行遗传学与进化论领域的科学研究；1927～1931年，担任美国科学院院长；1928年退休，同年发表名著“基因论”；1928～1945年，任加州大学生物学主任；1930年，担任美国科学促进联合会主席；1933年，获诺贝尔生理学及医学奖；1945年12月4日，因动脉血管破裂在美国加州的帕萨迪纳市逝世。2.果蝇的生物学特性

繁殖能力强，产卵数量多；繁殖速度快，世代时间短（9天左右）；染色体数目少，仅4对，且形态各异，易于辨认；拥有大量的各种突变体；个体小，管理简单，对饲料无特殊要求。3.连锁与交换定律基因的连锁与交换定律，是由美国著名的遗传学及胚胎学家摩尔根与他的学生所建立的。由于该定律极大地完善并丰富了孟德尔遗传学理论，因此后人将它与孟德尔第一遗传定律、第二遗传定律并列，称之为遗传学第三定律。a.基因的遗传与连锁位于同一条染色体上的两个或两个以上的基因，连系在一起共同遗传的现象叫连锁；而把分别位于一对同源染色体上的两条子染色体上的基因，在细胞分裂过程中发生对调的遗传现象，称为交换。4.摩尔根的学术贡献摩尔根及其学术的工作，第一次将代表某一特定性状的基因，同某一特定的染色体连系了起来，从而确证了基因的遗传物质基因，建立了基因的染色体理论，为基因工程的建立作了卓越的贡献。摩尔根生活低调，衣着朴素，热心科研，勤奋工作，知道38岁才与其女友结婚。为了不影响科研工作，摩尔根借故没有出席诺贝尔奖的颁奖典礼。他总结自己为什么会在科学研究中作出诸多发现的原因时说“一靠勤奋，二靠实验材料得当，三靠愿意放弃没有任何证据的假说，最后还得少开些遗传学大会”。三、基因的载体是DNA在孟德尔和摩尔根的基因论被科学工作者广泛接受之后，关于基因的载体（或说是化学本质）是DNA还是蛋白质，一直存在着两种不同的意见。1.1944年，O.Avery等人的肺炎链球菌毒性转化实验证明，基因的载体是DNA，而不是蛋白质。S型肺炎链球菌――具荚膜，光滑，有毒。R型肺炎链球菌――无荚膜，粗糙，无毒。2.1952年，A.DHersheyandM.Chase应用放射性同位素双标记技术，证明菌体的遗传物质（基因的载体）也是DNA而不是蛋白质。实验现象：用放射性同位素32P和35S分别标记噬菌体的内部DNA和外部蛋白质，然后感染寄主细胞。结果发现只有32P标记的DNA注入大肠杆菌细胞。结论：在噬菌体中，基因的载体也是DNA而不是蛋白质。

3.1953年，J.Watson和F.Crick建立了DNA的双螺旋模型；1958年，M.Meselson和F.W.Stahl在此基础上发现了DNA分子半保留复制机理。从而解决了基因的自我复制和代代相传的问题。至此，基因的分子本质是DNA而不是蛋白质已是不争的事实！

DNA分子的半保留复制模型四、基因的编码产物基因是细胞中所有RNA及蛋白质分子的“蓝图”，有些基因编码的最终产物是RNA分子，例如rRNA基因、tRNA基因及其它小分子量的RNA基因等；而其它一些基因编码的最终产物是蛋白质，这些蛋白质是通过mRNA中介合成的。1.1941年，G.W.Beadle和E.L.Tatum建立了“Onegene－Oneenzyme”理论。根据上述发现推导出如下这样的假说：一种基因负责合成一种酶，如果这种基因是缺陷的，那么这种酶也是缺陷的。X－射线诱导Neurosporecrassa产生许多突变体鉴定出营养缺陷型突变体（Auxotrophicmutant），这些突变体在补加有相应营养物质的培养基中生长，便可得到富集。因此便于对某一种生化缺陷进行研究。关于这些营养缺陷突变体的遗传分析表明，其中每一种突变体都是由于单个基因缺陷（singlegenedefect）所致。2.1957年，V.Zngram对镰形细胞贫血症（sicklecellanemia）的研究中进一步直接证明蛋白质与基因之间的直接关系。这主要得益于刚刚发明的氨基酸序列分析法，分析成年人血红蛋白的α链和β链，证明镰形血红蛋白α链中没有任何变化，但β链与野生型相比，在其氨基端第6个氨基酸由缬氨酸取代了正常的谷氨酸。这表明基因的突变会直接影响到它编码的蛋白质多肽链成分的改变，从而证实了“一种基因一种酶”的假说是正确的。3.蛋白质结构研究多体蛋白质（multimericproteins）：由数个亚基组成。a.

各种亚基相同的蛋白质叫作同型多体蛋白质（homomultimer），由一种基因编码。b.

由不同的亚基构成的多体蛋白质叫作异型多体蛋白质（heteromultimer），由多种基因编码。因此“一种基因一种酶”这一理论便被修正为“一种基因一种多肽链”（Onegene－Onepolypeptidechain）。4.基因与蛋白质数量的关系基因是遗传信息，基因功能的展现，取决于基因编码的蛋白质，它是生命活动的直接参与者。由于基因表达过程存在着精细的调控左右，因此，一个生物体所表达的蛋白质数量实际上要远远地超过基因的数量。据统计，若人体共有5×104个基因，那么所表达的蛋白质则可多达2×106种以上。五、遗传密码的破译－－DNA的核苷酸顺序与蛋白质氨基酸顺序关系

Beadle、Tatum和Ingram等人的工作，虽然确立了基因（DNA）与蛋白质多肽链之间的关系，也就是说蛋白质是由基因编码的，但是，基因的DNA分子是由4种不同的核苷酸（A、T、G和C）排列组合而成的，而蛋白质分子中的多肽链则是由20种氨基酸排列组合而成。那么基因DNA分子中的核苷酸碱基顺序，同蛋白质多肽链中的氨基酸顺序之间存在着什么样的关系呢？遗传密码的破译正确地回答了这个问题。1958年，F.Crick提出了解释DNA，RNA及蛋白质三者关系的所谓中心法则：1.中心法则DNARNA蛋白质根据中心法则DNA会自我复制，而RNA及蛋白质二者都不能够自我复制，因此生物体中能够永久保存代代相传下去的是DNA分子，或说是基因。DNA在复制过程中双链解开，以单链形式作为合成自己互补链（cDNA）的模板，其碱基配对原则是：腺嘌呤（A）－胸腺嘧啶（T）鸟嘌呤（G）－胞嘧啶（C）在DNA到RNA的转录过程中，单链的cDNA则是作为指导RNA合成的模板。RNA可分成tRNA、rRNA、其它小分子RNA和mRNA，其中只有mRNA可转译成蛋白质。转录过程中的碱基配对原则：腺嘌呤（A）－尿嘧啶（U）鸟嘌呤（G）－胞嘧啶（C）

2.遗传密码遗传信息从DNA到RNA再到蛋白质的过程，叫作基因的表达。它涉及遗传信息的转录和转译两个步骤。转录――根据碱基互补原则，遗传信息从DNA的核苷酸序列形式转换成RNA核苷酸序列形式的过程叫作转录，也叫RNA合成。转译――遗传信息从mRNA的核苷酸序列形式，转变成蛋白质多肽链氨基酸序列形式的过程叫作转译，也叫蛋白质合成。当我们思考转录和转译这两个过程时会发现，转译与转录不同，它不是简单的核苷酸序列的转换过程，而是将mRNA分子上的核苷酸语言翻译成蛋白质多肽链上氨基酸语言的负责过程，是涉及到两种不同语言信号之间的更换问题。因此，在从mRNA到蛋白质多肽链的转译过程中，必定存在着一种特殊的遗传密码系统，才能够将RNA分子上的核苷酸顺序，同蛋白质多肽链分子上的氨基酸顺序联系。这种遗传密码在1966年已经完全破译。3.通用遗传密码表注1.Met和Val的密码子AUG和GUG，也叫起始密码子，表中加方框表示。注2.UAA、UAG及UGA三个密码子为终止密码子，表中以“Stop”表示。第一位字母（5’-末端）第二位字母第三位字母（3’-末端）UUCAGUCAGPhePheLeuLeuSerSerSerSerTyrTyrStopStopCysCysStopTrpCLeuLeuLeuLeuProProProProHisHisGlnGlnArgArgArgArgUCAGAIleIleIleMetThrThrThrThrAsnAsnLysLysSerSerArgArgUCAGGValValValValAlaAlaAlaAlaAspAspGluGluGlyGlyGlyGlyUCAG六、基因的结构按照细胞中是否存在真正有形的细胞核结构，可把生物分成真核生物和原核生物两大类。例如大肠杆菌细胞中的染色体并没有被核膜包围，因此没有真正的有形的细胞核结构，属于原核生物。而诸如高等植物和动物，细胞中的染色体被核膜包围成一种有形的细胞核结构，属于真核生物。与此相应，也可把基因分成真核基因和原核基因两大类，两者在结构上是有差别的。原核细胞的基因结构原核细胞基因编码区（编码序列）：能指导有关蛋白质的合成，即能够编码蛋白质非编码区（调控序列）：位于编码区上游和编码区下游的DNA序列，虽不能指导有关蛋白质的合成，但有调控遗传信息表达的核苷酸序列，如启动子、终止子等原核细胞的基因结构

RNA聚合酶的作用是催化DNA转录为RNA。它能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并与DNA分子的一条链为模板合成RNA。真核细胞的基因结构与原核细胞比较，真核细胞基因结构的主要特点是：编码区是间隔的、不连续的。也就是说，能够编码蛋白质的序列被不能够编码蛋白质的序列分隔开来，成为一种断裂的形式。其中，能够编码蛋白质的序列叫做外显子，一般不能够编码蛋白质的序列叫做内含子。真核细胞的基因结构真核细胞基因编码区（间隔、不连续）外显子：能编码蛋白质的DNA序列内含子：不能编码蛋白质的DNA序列非编码区：与原核生物具有相似功能的启动子、终止子原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞真核细胞不同点编码区是连续的编码区是间隔的、不连续的相同点都由能够编码蛋白质的编码区和具有调控作用的非编码区组成的基因的基本组成部分

编码区――包括起始密码子，终止密码子和氨基酸密码子；非编码区――5’-末端非转译区，3’-末端非转译区，真核基因的间隔区；启动区――RNA聚合酶结合部位，由此启动基因的转录作用；终止区――具有终止转录作用的功能。不管是真核基因还是原核基因，都具有如下4个基本的组成部分：基因的种类（1）编码蛋白质的基因：包括结构基因和调节基因。（2）没有转译产物的基因：如rRNA基因和tRNA基因。（3）不能转录的DNA片段：如操纵基因。启动子与终止子

启动子是在非编码区内紧靠转录起点，调控遗传信息表达的脱氧核苷酸序列，它能引导RNA聚合酶与正确的基因部位结合，使转录从起点开始，沿编码区进行。终止子是在非编码区内紧靠转录终点，调控遗传信息表达的脱氧核苷酸序列，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。（一）理论上的3大发现：1.20世纪40年代，Avery发现了生物遗传物质的化学本质是DNA。超越时代的科学成就往往不易被人们接受，Avery当时并未赢得阵阵掌声，他的论文事隔10年以后才公开发表。2.20世纪50年代，Watson-crick提出了DNA结构的双螺旋结构模型，搞清楚了生物遗传物质的分子机制。3.20世纪60年代，确定了遗传信息的传递方式：DNA→RNA→Pr,破译了全部遗传密码，43。七．基因工程3大理论，3大技术准备：（二）技术上的3大发明：

1．“基因剪刀”－限制性内切酶的发明

（1）20世纪40－60年代，科学家们就为基因工程设计了美好的蓝图，但是面对庞大的dsDNA（104，2.2*1011公里）束手无策，无从下手把它切成单个基因片断。（2）当时的酶学知识已有相当的发展，但是没有一个已发现的酶能完成这样的使命。（3）1970年，Smith和Wilcox在流感嗜血杆菌（Haemophilus

inffuenzae）分离纯化了HindⅡ，取得了突破，打破了基因工程的禁锢，迎来了改造生物的春天，为基因工程奠定了最为重要的技术基础。

2．载体(“交通工具车子”)－基因工程技术诞生的第二个技术准备

（1）

有了切割与缝合（ligase）基因DNA的工具，还得有一个车子（富康）将重组DNA送到宿主细胞中去。（2）1946年起，Lederberg就研究细菌性因子（F因子）.50-60年代相继发现了R因子（抗药因子），CoE(大肠杆菌因子)等质粒。（3）然而，直到1973年Cohen才能将质粒作为基因工程载体使用（至今一直是基因工程最重要最广泛使用的载体）。这是基因工程的第二个技术准备。

3．逆转录酶－1970年Baltimove和Temin等同时各自发现了逆转录酶，打破了遗传学（生物学）中心法则，使真核基因的制备成为可能。（原因如下）

(1)真核基因组庞大而复杂，不易制得基因图谱。HGP2005年完成，2.8万个基因，1－3kb/基因，104，2.2*1011公里。（2）即使有了基因图谱，因为真核基因有内含子，不能在原核表达系统剪接出mRNA，没有成熟的mRNA就不能得到相应得产物。（3）经过逆转录mRNA→cDNA(complementoryDNA)文库要比基因组文库小得多，所以筛选阳性克隆就方便得多。有了这些理论核技术的武装，基因工程的临盆降生指日可待，Berg和Cohen两位科学的“助产士”，把基因工程接到了人间。

（1）基因基因是遗传信息的基本单位。基因是一种物理实体，是一种化学分子，通过改变这个分子的结构可以改变基因的信息内容，从而改变相应的生理功能。基因通过指导蛋白质或RNA分子的产生，或者通过影响其他基因产生这些产物的方式来发挥其生理功能。八．基因及基因工程的概念

在染色体或DNA分子上，基因呈线性排列，并非所有的DNA序列都是基因，而只有其中某一特定的多核苷酸区段才是基因的编码区，因此基因是有特定功能的DNA片段。一般来说，一个基因大约含有1500个核苷酸对，基因本身也具有线性结构。

（2）基因组(Genome)基因组是指一个物种的单倍体的染色体所携带的全部基因。对于多数只有一个染色体的原核生物来讲，如细菌、噬菌体它的整个染色体所包含的全部基因组成其基因组。但对于通常的二倍体高等生物来讲是指能维持配子或配子体正常功能的最低数目的一套染色体所包含的全部基因。七．基因及基因工程的概念（3）基因工程（geneticengineering）

以分子遗传学为基础，在体外对DNA进行切割、拼接,使遗传物质重新组合,经载体转移到细胞中扩增表达,获得人类所需产品,或组建新生物类型的技术。

除了少数RNA病毒外，几乎所有的基因都存在于DNA结构中，而用于外源基因重组拼接的载体也都是DNA分子，因此基因工程也称为重组DNA技术(DNARecombination)。DNA重组分子大都需在受体细胞中复制扩增，故还可将基因工程表征为基因克隆(Genecloning)或分子克隆(Molecularcloning)。基因工程的基本特点是，分子水平操作，细胞水平表达。（4）．与基因工程相关的概念：1.克隆（clone,cloning）：原意是指单细胞纯系无性繁殖。通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。获取这一群体的过程称为克隆化（cloning）。现代概念是是按人类的意愿，在体外对DNA分子进行重组，再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得该DNA分子的大量拷贝的技术。由于整个操作在分子水平上进行，所以称为分子克隆（molecularcloning）。2.重组DNA技术(DNArecombinationtechnique)是用酶学的方法将不同来源的DNA在体外切割，连接组成一个杂合的DNA分子的技术。基因工程包括DNA重组技术。

我们应该记住他们——1.第一个实现DNA重组的人－Berg1972年，Berg用E.coRⅠ切割SV40DNA和λphageDNA，经过连接组成重组的DNA分子。Berg是第一个实现DNA重组的人。

2.第一个取得基因工程成功的人－Cohen

1973年，CohenGroup将E.coli的tetr质粒psclol和nersrR6-3质粒体外限制酶切割，连接成一个新的质粒，转化E.coli，在含四环素和新霉素的平板上筛选出了terrNer,实现了细菌遗传性状的转移。这是基因工程史上的第一个克隆化并取得成功的例子，这一年被定为基因工程诞生的元年。第二节基因工程概述基因工程克隆技术――人类对自然的干预（一）遗传和变异是生物学的一对重要概念。

1.遗传赋予生物种的稳定，保证生物种的延绵不断（不能断香火）。

2.变异赋予生物种的进化，保证生物种对环境的适应。

3.遗传和变异这一对矛盾在一个生物体内统一起来。

4.在生物演变的历史长河中，自然发生的变异是相当相当缓慢的。

5.随着生物科学的发展，尤其是基因工程技术的诞生，人类开始干预生物的变异（福耶祸耶？无法定论）

6.经典的遗传学千百万年才能积累出现的有利的变异，通过基因工程手段几十年乃至几年就可以实现。而时至今日，几乎一发不可收拾。

(二)多利

1997．2．23．，Nature杂志报道，英国爱丁斯堡罗斯林研究所和PPL生物技术公司已经成功克隆了一只名叫多利的绵羊（1997－2003/7/12）。这一消息的公布，全世界震惊的程度不亚于原子弹在长崎和广岛的爆炸，在全球引起了轩然大波，以至世人惊呼：不要让科学疯狂！为什么以前胚胎克隆没有在世界上引起轩然大波呢?原因是此克隆非彼克隆，多利取自功能彻底分化的成年动物乳腺细胞，即体细胞。它推翻了遗传学上一条上百年的定律：体细胞功能高度分化，不可能重新发育成个体。（三）多利诞生的过程

为什么震惊和惊呼，我们先了解一下多利诞生的过程以及胚胎细胞克隆和体细胞克隆的区别这两个基本问题，对我们学习后面内容或许有所帮助和启发。多利诞生的过程：

1.取出第一只成年母羊乳腺的普通细胞，分离基因备用。

2.取出第二只母羊未受精的卵细胞，取出基因换上第一只羊乳腺细胞基因（“掉包”），放电激活该卵细胞，使之象正常受精卵一样进行细胞分裂，直至一定阶段，胚胎成熟。

3.将成熟的胚胎移植到第三只母羊子宫中发育，妊娠（同正常一样），最后产下多利。这样一只与第一只羊基因百分之百一样的复制品诞生了。

（四）此克隆非彼克隆

胚胎细胞克隆体细胞克隆供体细胞胚胎细胞（核）体细胞（核）受体细胞去核未受精的卵细胞去核未受精的卵细胞发育场所母体宫腔母体宫腔关键区别克隆的是子代（多生了一个）复制的是自己（复制了一个）（五）克隆是一把双刃剑

试想，有了克隆技术，有人在你毫不知晓的情况下复制一个“你”去犯罪，怎么办？试想，有了克隆技术，一些极权的政治野心家一下子克隆出好几个战争狂人希特勒、墨索里尼，怎么办？还有，有了克隆技术，世界上同时生活着多个你、我、父母、兄弟、姐妹，按现行的社会伦理道德很难为其“名份”定位，又该怎么办？因此说克隆对人类社会伦理道德提出了一场非同寻常的挑战，平添一系列是我非我、是父非父、是妻非妻、是子非子之类的麻烦事，绝非危言耸听。从社会伦理角度看，用克隆技术培育出的人，有其特定的生理性状，这对人类的自然发展和人种的自然构成无疑会产生极大的影响。

从家庭伦理角度看，将克隆技术用于人体繁殖，会加剧家庭多元化倾向，还会从根本上改变人的亲系关系，确定人类亲系关系的标准也将发生改变。从性伦理角度看，它完全改变了人类自然的基于性爱的生育方式，使人口的生产与性爱分离，从而破坏男女之间基于性受而获得后代的情感，并由此改变人类的基本性伦理关系。从遗传学上看，人本来是由两性细胞结合而产生的，这种结合有利于人种进化，而克隆使人的遗传基因成为单一的，势必导致人种退化。从哲学上看，克隆还会使人们正常的生与死的概念发生动摇。基因工程的基本工具

基因工程需要哪些基本工具?基因工程至少需要3种工具：限制性核酸内切酶——“分子手术刀”DNA连接酶——“分子缝合针”基因进入受体细胞的运载体——“分子运输车”2.1工具酶常用的工具酶（toolenzymes）有：

1.限制性核酸内切酶（resriction

enzymes,restriction

endonadease)2.DNA连接酶（DNAligase,ligase)3.逆转录酶(reversetranscriptase)4.DNA聚合酶(DNApolymerase,DNA

pol)5.核酸酶(nuclease)6.末端转移酶(terminaltransferase)7.碱性磷酸酶(BAP或CIP)以1.和2.最为常用，最为重要。工具酶现已商品化。一．限制性核酸内切酶（一）限制酶的概念（定义，分类，命名，限制与修饰辨正关系）

1.定义限制酶（restrictionendonuclease,restrctionenzymes）是一类专门切割DNA的酶，它们能特异结合一段被称为限制酶识别顺序的特殊DNA序列。并切割dsDNA。所谓限制（restriction）=切割（clearage）=水解（hydrolysis）该部位的核苷键（磷酸二酯键）

2.分类限制酶都是从原核生物中发现的（400多种E/350M）。所有的限制酶可分成3类。

（1）Ⅰ、Ⅲ型，兼具限制与修饰活性，它们识别与切割顺序不在一个地方，不产生特异性的DNA片段，与基因工程意义不大（有说Ⅲ型识别核切割的位点一致，但罕见）。

（2）Ⅱ型基因工程说到的限制酶是Ⅱ型酶，具有此类酶的微生物限制－修饰系统分别由限制酶核甲基化酶来完成。Ⅱ型酶分子量小，仅需Mg2＋作为催化反应的辅因子，识别与切割位点相同，产生特异的DNA片段。3.

命名（1973年Smith和Nathaus

原则、Ⅱ型酶）根据分离此酶微生物的学名，一般取3个字母。第一个字母大写该微生物属名的前第一个字母第二、三个字母小写该微生物种名的前2个字母第四个字母大写有变种或品系的第一个字母罗马字母Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ从一种微生物中发现了几种限制酶，按发现顺序排列

如EcoRⅠ是指从大肠杆菌（Escherichiacoli）R株分离得到的第一种限制酶。

(二)限制酶的识别位点

1．

一般特征（4点）：（1）Ⅱ型酶识别的特殊DNA序列称为限制酶的识别位点（或切割位点）。

（2）它能识别dsDNA的4－6bp的回文序列并水解该部分的核苷键。一般来说是4－6bp，有6个以上的，但没有4个以下的。（3）识别顺序呈二重对称，即1800旋转对称。如：

GCCGGTNACGAATTC

HhaCGGCMaeⅢCANTGEcoRⅠCTTAAG(4)酶靶顺序大小是很重要的，它决定产生特定DNA中段的大小。

双链DNA中的一段倒置重复序列，当该序列的双链被打开后，可形成发夹结构。这段序列被称为回文序列。其特点是在该段的碱基序列的互补链之间正读反读都相同（并非在同一条链上正读反读）。例如5'GGTACC3'

3'CCATGG5'

2.识别简并序列;

简并序列是指序列中有核苷酸位可以是不同的核苷酸。如：

GTYRACY=C或TR=G或AYR=CG或CA或TG或TA

HinⅡ实际上可以识别4个特定序列。

3.识别位点与切割位点不同，但二者距离是一定的(某些酶识别位点在切割位点附近),即产生特定的DNA片段，这是与Ⅰ型酶的区别之一。

HgaⅠ识别位点GACGC→5/10(核苷酸距离)→dsDNA上切割

5ˊGACGCNNNNN↓NNNNN3ˊ3ˊCTGCGNNNNNNNNNN↑5ˊ

先识别（搞清楚）滑行一段距离再切，此称为Distantcleavage

(三)限制酶的切割位点：限制性对dsDNA2条链同时切割（其具体切割点，即磷酸二酯键断开的位点，相对二重对称轴的位置而异）产生3种不同切口：1．

形成平头末端（flush或bluntend）在识别序列对称轴处平齐切割DNA两条链而形成的平头双链末端。如－TC↓GA-smaⅠbsuRⅠor–TC3ˊ+5ˊGA-

－AG↓CT-AluⅠ-AG5ˊ+3ˊCT-2.形成5′－粘性末端（5′－cohesiveend即3′延伸末端）

5′-GAATTC3′EcoRⅠ5′-GAATTC-3′+3′-CTTAAG5′3′-CTTAAG-5′3.形成3′－粘性末端（3′－cohesiveend）

5′CTGCAG3′pstⅠG-3′5′-CTGCA+3′GACGTC5′ACGTC-5′3′-G

粘性末端（stickyend）—限制酶切割DNA双链而形成彼此互补的单链末端。二．DNA连接酶：

DNA连接酶是基因工程第二位重要的工具酶，常用T4DNAligase.

（一）功能：催化有互补顺序的两个dsDNA分子的粘性末端或平头末端3′－OH、5′－P连接作用。（二）来源－噬菌体T4感染Ecoli分离的一种单链多肽酶、MW.68KD（1KD=1000道尔顿）。（三）催化反应：

（1）需要ATP、Mg2+作辅助因子；（2）缺刻（Nick）DNA也可作该酶的底物。（3）对粘性末端催化活性大于平头末端（酶量1：100）三、逆转录酶（一）概述

逆转录酶也称反转录酶或RNA依赖的DNA聚合酶（RNAdependentDNApolymerase,RDDP）。是由Baltimove从鼠白血病病毒（murineleukemiavirus,MLV）和Mizutan从劳氏肉瘤病毒(Roussarcomavirus,RSV)中，于1970年分别各自发现的，这两个小组论文同时在同一期Nature上，可见其意义。该酶在逆转录病毒（retrovirus）生产循环中起主宰作用。（二）功能基因工程中主要用于逆转录mRNA→cDNA（complementoryDNA）。使用该酶可以获得目的基因，也可以用来标记cDNA作为放射性探针.（三）商品化逆转录酶有两种

①AMV（禽成髓细胞瘤）②Mc-MLV(鼠白血病病毒)。四、DNA聚合酶：

DNA聚合酶以DNA为模板合成DNA，基因工程常用的酶有：（一）大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（E.coliDNApolⅠ）

1956年，A.kornberg首先从E.coli中分离得到。是由1条多肽链组成的球蛋白直径65，MW109KD，并以蛋白敏感的多肽接头折叠成两个区域含19－45％а螺旋结构，分子中有单链巯基，每分子含1个Zn2＋原子，还不能证明Zn2＋参加了催化反应，酶活性中心有3个密切相连的结合位点－即DNA核模，核苷磷酸（估计引物，生长链痘结合在这里）和dNTP(脱氧核苷三磷酸)结合位点。

1．E.coliDNApol由大小两亚基组成，具有3种酶活性，即大亚基5′→3′DNA聚合酶，3′→5′外切酶及小亚基的5′→3′外切酶活性：（1）5′→3′DNA聚合酶活性以ssDNA为模板，沿引物3′－OH方向，按模板顺序从5′→3′延伸。

5′CCGATA－OHE.coliDNApolⅠ5′CCGATAGCCT3′3′GGCTATCGGA5′Mg2＋dDNP3′GGCTCGGA5′

（2）3′→5′外切酶活性即从游离的3′－OH末端降解ssDNA或dsDNA，其意义在于识别和消除不配对的核酸，保证DNA复制的忠实性。其dsDNA外切活性可被5′→3′聚合活性所抑制。

5’CGCATCG-OH3’E.coliDNApolⅠ5’CGC3’GCGMg2＋

3’GCG＋dAdTdCdG（3）5′→3′外切酶活性：从游离的5’端降解dsDNA成单核苷酸或寡核苷酸，也降解DNA:RNA杂交体RNA成分（具有RnaseH活性）5’－CTCATTAG－3’E.coliDNApolⅠ5’－CATTAG3’－GCGTAATC－5’Mg2＋

3’－GCGTAATC+pC,pG（二）大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的大片段－Klenow片段酶

基因工程很多情况下，E.coliDNApolⅠ可用它的1个大片段Klenow片段酶代替。该酶是枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶降解E.coliDNApolⅠ所得到的。

1.Klenow大片段是一条多肽链，MW76KD，保留了E.coli

polⅠ的5′→3′DNA聚合酶，3′→5′外切酶活性。

2.Klenow在基因工程用于：

(1)补平用限制酶消化dsDNA得到的5’粘性末端（即3’延伸末端）

5’－G-OHKlenow,Mg2＋5’－GAATT3’－CTTAADntp3’－CTTAA(2)同（1），填平过程中，用32pdNTP标记DNA片段3’末端。

(3)cDNA克隆了中，用于合成cDNA的第二条链。

五．核酸酶

常用的是单链特异的SI核酸酶（核酸酶SI,nucleaseSI，SI）和BAL31。（一）核酸酶SI(SI核酸酶，nucleaseSI，SI，常用的核酸酶)

1.来源源于米曲霉素（aspergillusoryzas）

2.酶作用底物ssDNA、ssRNA、dsDNA、或DNA-RNA杂交链。

3.酶活性有低、中、极高3种情况变化－

(1)降解ssDNA或ssRNA形成5’p末端的单或寡核苷酸，对DNA活性强于>RNA(2)中量SI可从切口（Nick）或小缺口（smallgaps）处降解dsDNA，

(3)极大量的SI才能讲解dsDNA或DNA-RNA杂交链，原因是后者对SI讲解有抗性，所以SI又称单链特异的核酸酶。在基因工程中用于：①去除DNA片段的粘性末端而产生平端。②打开cDNA中的发夹环，使其成平端。③分析DNA：RNA杂交体结构，可证明基因内部内含子的存在（当一条DNA与它的mRNA杂交时，如果杂交链中有RNA－loop环，SI可切开这个环，这是基因中有间隔顺序证明。六、碱性磷酸酶（alkalinephoptase,APE）

APE包括BAP（细菌碱性磷酶和CIP（小肠碱性磷酶）。功用如下：（一）去除DNA、RNA和dNTP（脱氧核糖核苷三磷酸）的5ˊ磷酸根。（二）去除5ˊ-P，防止DNA片段或载体自身环化。（三）32p标记5ˊ—末端前，先用其去除DNA或RNA上的5ˊ-P。几种重要的工具酶的酶学性质及在基因工程中的应用酶来源活性

底物

辅因子

特点用途1.限制酶（Ⅱ）(restrictionendonuclease,restrctionenzymes）微生物400RE/350M内切dsDNAMg2＋特异性识别和切割dsDNA,产生平头或粘性（5’-3’-）末端1．DNA重组