水通道蛋白0在大鼠消化段的表达及其与消化道生理功能的相关性

水通道蛋白0在大鼠消化段的表达及其与消化道生理功能的相关性

《易乾》说“声音和气是一样的”，而《叶选医学平衡》说“湿的人喜欢浸泡在脾胃，它们的相位感也很相似。”。脾胃作为同居中焦,表里配属,阴阳相对的土象之脏,通过纳运协同、气机顺因、燥湿相济的方式维持着机体内部的水液代谢的平衡。水通道蛋白是目前研究较热的一类与水通透相关的细胞膜转运蛋白,编号从0～12,共计13种,广布于哺乳动物体内,尤其与吸收和分泌相关的内皮和上皮细胞中较多。文献已有1,2,3,4,5,7,8,9,10,12号蛋白在消化道表达的相关报道。鉴于二者可能在水液代谢方面存在因果关系,故本课题旨在通过对水通道蛋白在消化道分布情况的系统性研究,探求传统中医典型药证关系——平胃散对湿阻中焦证的可能调控机制。本文在实验的基础上,选择尚未或尚少见刊的水通道蛋白0做一定的相关阐述。1材料和机器1.1实验动物及检验标准SD大鼠50只,雌雄各半,体质量180～220g,由成都中医药大学实验动物中心提供,合格证号:SCXK(川)2004-11,检疫后备用。适应性饲养5d,自由摄食全价颗粒饲料,动物房温度维持在18～25℃左右。1.2特效药1.2.1造模用药1.2.2成都人人乐超市购买的熟猪油,自制4℃冰水。1.3制剂室鉴定平胃散(苍术24g、厚朴18g、陈皮12g、炙甘草6g),均购自同仁堂成都分店,经成都中医药大学制剂室鉴定合格。先将药物加水浸泡1h,然后与大枣2枚、生姜2片一同煎煮,最后浓缩成浓度为1g生药/ml的药液。1.4测试剂盒和dab显色试剂盒PBS缓冲液(博士德生物工程有限公司);兔sp检测试剂盒(中杉金桥,批号:701323A);DAB显色试剂盒(中杉金桥,LOT:614846A);AQP0(sc-99059,Lot:G2409)。1.5德国leica公司的研究对象自制造模箱;T-5000型电子天平(常熟双杰测试仪器厂);RM2245切片机,(德国Leica公司);HI1220烤片机(德国Leica公司);HI1210摊片机(德国Leica公司);EG1160包埋机(德国Leica公司);BX51研究显微镜(日本奥林巴斯公司);DFC-300FX数码显微摄像系统(德国Leica公司)。2方法2.1大鼠的日常饲养和分组SD大鼠50只,雌雄各半,随机成组,其中20只进行常规饲养,30只用于模型制备。以致湿病因为蓝本,分别从环境、饮食、情志三方面着手建立湿阻中焦证模型。将造模大鼠放在温度18～25℃,湿度(90±5)%的造模箱内饲养,模拟“久居湿地,外湿过盛”;造模大鼠于单日禁食并4℃冰水(2ml/只)灌胃一次,双日供应充足饲料并猪油(4ml/只)灌胃一次,模拟“饮食不节,饥饱失常”;令造模大鼠于每日9:00～16:00站在4cm深的水中,控制睡眠时间7h,扰乱其生物节律,模拟“情志不遂,水湿失布”;连续20d。造模结束当日,常规饲养的20只大鼠随机分为空白组和空白给药组,已造模的30只大鼠随机分为湿阻中焦证模型组(模型组)、平胃散治疗组(平胃散组)和自然恢复组。并把空白组和模型组处死取材。次日空白给药组和平胃散治疗组大鼠给予平胃散汤剂灌胃(10ml/kg),同时空白组和自然恢复组0.9%生理盐水灌胃(10ml/kg),给药3d后处死取材。2.2中性甲醛法取胃贲门(从贲门中间分开,右侧固定)、胃体中部(右侧固定)、小肠中段(取距幽门16～21cm之间,16～18cm固定)、大肠中段(取距盲端6～11cm之间,6～8cm固定)、大肠末端(取距肛门5cm,2.5～5cm固定),以上各部组织均已生理盐水冲净内容物后固定于15%的中性甲醛(PBS配制),48h后制成病理石蜡包埋块,4℃冰箱冻存备用。2.3抗氧化活性测定采用免疫组织化学技术对AQP0在胃肠组织的分布情况进行检测:以4μm厚度连续切片,60℃烘箱过夜;二甲苯I、II、III脱蜡,共3次,15min/次;无水乙醇I、II各5min;95%乙醇I、II各5min,80%、70%乙醇各5min,流水冲洗后浸泡于蒸馏水中备用;PBS浸洗2次各5min;中火、于pH6.0的枸橼酸缓冲液中进行抗原修复;用蒸馏水配制新鲜的3%H2O2,室温封闭5～10min,用蒸馏水洗1次;PBS浸洗3min×3;滴加正常山羊血清封闭液(1∶10),室温20min,甩去多余液体;滴加Ι抗50μl,4℃过夜;PBS洗3min×3;滴加生物素化Ⅱ抗(1∶100),25℃15min;PBS洗5min×4;滴加试剂SABC(1∶100)25℃15min;PBS洗3min×3;DAB显色:3～15min;脱水、透明、封片、镜检。2.4“”的表达以抗原抗体结合处特异性显色的分布面积分5级强度,“-”表示阴性,无表达;“±”表示略阳性,似有表达;“+”表示阳性范围小,有表达;“++”表示阳性范围近一半,表达明显;“+++”表示阳性分布接近整个区域,表达十分明显。3结果3.1胃反应对7d后aqp0表达的影响见表1。由表1可知,AQP0主要在胃肠组织的黏膜层表达,外膜处可有疑似表达,黏膜下层和肌层基无表达。空白组与模型组相较而言:AQP0在胃贲门黏膜层表达有增加的趋势。自然恢复3d后,相较于模型组:AQP0在胃贲门黏膜层,大、小肠中段表达有增加的趋势,胃体中间有降低的趋势。经平胃散干预3天后,相较于模型组:AQP0在胃贲门和大肠中段黏膜层有增加的趋势,胃体中部和小肠中段黏膜的表达略有降低。且平胃散干预组与自然恢复组比较,AQP0在胃贲门、胃体中部、小肠中段黏膜层的表达有所降低。同时,空白给药组相较于空白组而言:AQP0在消化道各段黏膜层的分布有增加的趋势。3.2胃组织aqp0的分布图见图1～5。4平胃散对湿阻中焦证病理表型的影响4.1湿阻中焦证病理动物模型的AQP0在消化道的表达谱分析湿阻中焦证以全身困倦、胸脘痞闷、腹胀便溏、口黏苔腻为主要表现,是临床中医常见的消化系统疾病证型。本实验通过对AQP0关于湿阻中焦动物病理模型的观察,发现相较于空白组而言,AQP0在胃贲门黏膜层表达有降低的趋势。作为有弱的水通透性的AQP0,其表达的降低可导致细胞通透性的降低,从而引发胃部组织水肿,降低胃部神经的敏感性和肌肉组织的节律性,影响胃对饮食物的消化吸收。与中医湿阻中焦证之胸脘痞闷,纳差腹胀等症状基本相符,故AQP0可能是从分子水平揭示湿阻中焦证胸脘痞闷,纳差腹胀等症状的有力依据。自然恢复3d后,AQP0在胃体中间有降低趋势看似异常,但有研究认为AQP0存在着pH依赖性调节,胃体处大部分分布的胃底腺是分泌胃液的主要腺体,故推测胃部腺体功能的差异可能对AQP0的表达产生一定影响,此种表达现象可能是pH和模型作用综合调控的结果。大肠末段各组实验结果结类于阴性表达,可能是因为所取组织叫靠近肛门,顺应功能需要,黏膜层细胞有向复层扁平上皮转化的趋势,因而吸收功能减弱相关。4.2平胃散作用后湿阻中焦证病理动物模型的AQP0在消化道的表达谱分析平胃散原载于《太平惠民和剂局方》,功效燥湿健脾,消痞和胃,是治疗湿滞脾胃的基础。分析表明:空白给药组相较于空白组而言:AQP0在消化道各段黏膜层的分布有增加的趋势,平胃散干预3天后:AQP0在胃贲门和大肠中段黏膜的表达相对于模型组有增加的趋势,均提示平胃散具有排泄水湿、健运脾胃的功效。AQ