lc-msms法测定人血浆中氯雷他定浓度及其生物等效性评价

lc-msms法测定人血浆中氯雷他定浓度及其生物等效性评价

氯仿-1的化学名称为4-（8-氯-5，6-二羟基-11h-苯并环）-1-吡啶丙烯酸-乙酰胺。这是第二代抗凝剂，用于竞争菲涅耳第一胺受体，并抑制菲涅耳第一胺引起的过敏症状。对变态反应中黏附分子的表达有抑制作用,尤其对于细胞间黏附分子与血管细胞黏附分子的表达有明显抑制作用,可降低炎症细胞向过敏灶的趋化,从而控制过敏的迟发相反应。氯雷他定口服制剂临床上用于缓解过敏性鼻炎有关的症状,如喷嚏、流涕、鼻痒鼻塞以及眼部痒和烧灼感,口服药物后鼻和眼部症状及体征得以迅速缓解;亦适用于缓解慢性荨麻疹、瘙痒性皮肤病及其他过敏性皮肤病的症状及体征。近几年,国内外对人血浆氯雷他定浓度的测定方法有液相色谱紫外检测法(LC-UV)、液相色谱荧光检测法(LC-FD)、液相色谱-串联质谱联用法(LC-MS/MS)等,但都存在一定的局限性。如:样本处理过程复杂,采用多次液-液萃取的方法或采用比较昂贵的固相萃取法;样本处理方法血浆用量大(>500μL),流动相用量大(>0.5mL·min-1),检测时间长(>5min)等。另外,氯雷他定在体内主要经CYP3A4和CYP2D6代谢,其体内暴露量(Cmax和AUC)受遗传多态性的影响而存在较大的个体间差异,现有报道的研究数据已显示这些特征[1,2,3,4,5,6,8,9,10,11]。因此,若采用氯雷他定口服制剂的临床单次常用剂量10mg为给药剂量进行药动学及生物等效性研究,上述部分方法在定量范围方面还存在局限性,如:灵敏度较低[1,2,3,4,5,7,8,10,11],无法满足测定3～5个消除半衰期时样本中的药物浓度或检测出Cmax的1/10～1/20的药物浓度;定量上限(ULOQ)较低,不能直接测定部分高浓度的生物样本,而需要进行稀释复测。本实验建立了快速、灵敏、准确、专属性强、重复性好的LC-MS/MS方法,成功应用于22名健康受试者单次口服10mg氯雷他定片受试制剂和参比制剂后血浆氯雷他定浓度的测定,并评价了两种制剂的生物等效性。仪器、药品和试剂API3200型三重四极杆串联质谱仪(配有电喷雾离子化源(ESI)以及Analyst1.4.2数据处理软件,美国AppliedBiosystems公司);Prominence20A液相色谱仪(包括LC20AD型二元泵,DGU20A3型脱气机,SIL20A型自动进样器,CTO20A型柱温箱,CBM20A系统控制器,日本Shimadzu公司);QB600型高速振荡混合器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司);Sigma318K台式高速离心机(德国SartoriusStedimBiotech公司);MTN2800D氮吹浓缩装置(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)。氯雷他定片(受试制剂,规格:每片10mg,北京京丰制药有限公司,批号:101201);氯雷他定片(商品名:开瑞坦,参比制剂,规格:每片10mg,上海先灵葆雅制药有限公司,批号:09DRXF1008);氯雷他定对照品(纯度为100.06%,北京京丰制药有限公司,批号:0811191);地西泮对照品(内标,纯度为99.9%,中国食品药品检定研究院,批号:171225-200903)。甲醇(色谱纯,美国Fisher公司,批号:102100);超纯水(由蒸馏水经KLZ艾柯纯水机纯化后制得);其他试剂均为分析纯。空白人血浆由航天中心医院提供或来自于健康受试者。方法和结果1层析条件和层析条件1.1kx-ods18柱在线过滤器(0.5μm,日本Shimadzu公司);分析柱:Shim-packXR-ODSC18柱(75mm×3mm,2.2μm,日本Shimadzu公司);流动相:甲醇-2mmol·L-1乙酸铵(90∶10);洗脱方式:等度洗脱;流速:0.30mL·min-1;柱温:30℃;进样量:10μL。1.2气体、空气动力学离子源:电喷雾离子源(ESI),正离子方式监测;离子喷射电压:4500V;温度:550℃;源内气体1(GS1,N2)压力:276kPa;气体2(GS2,N2)压力:310kPa;气帘气体(N2)压力:138kPa;碰撞气(CAD,N2)压力:21kPa;扫描方式为多重反应监测(MRM);用于定量分析的离子反应分别为m/z383.1→m/z337.1(氯雷他定)和m/z285.2→m/z193.2(地西泮),解簇电压(DP)分别为60和57V,碰撞能量(CE)分别为29和38eV;Q1和Q3分辨率均为LOW。2溶液和血浆样本的制备2.1氯雷定储存溶液的制备称取适量氯雷他定对照品,加甲醇-水(1∶1)溶解并稀释至刻度,配制成浓度为32.0μg·mL-1的氯雷他定储备液。2.2对照品血浆分别取适量氯雷他定储备液,用空白血浆稀释成浓度分别为0.0300,0.0900,0.500,2.50,10.0,20.0,40.0ng·mL-1的对照品血浆。2.3样品质量控制结构的制备分别取适量氯雷他定储备液,用空白血浆稀释成浓度分别为0.0900,2.50,32.0ng·mL-1的质控样本。2.4由质量控制溶液制备分别取适量氯雷他定储备液,用乙腈稀释成浓度分别为0.900,25.0,320ng·mL-1的质控溶液。2.5地西常用地西常用储备液称取适量地西泮对照品,加甲醇-水(1∶1)溶解并稀释至刻度,配制成浓度为100μg·mL-1的地西泮储备液。取适量地西泮储备液,用甲醇-水(1∶1)稀释成浓度为50.0ng·mL-1的内标溶液。3lc-ms/ms分析精密取血浆样本500μL置于10mL玻璃管中,加入内标溶液100μL、0.5mol·L-1氢氧化钠溶液100μL、乙醚-正己烷(1∶1)3mL,涡流2min,3500r·min-1离心5min,上清液转移至另一10mL玻璃试管,于40℃恒温浴下氮气吹干,残渣用甲醇-水(1∶1)150μL复溶,涡流30s,复溶后的溶液全部转移至进样瓶中进行LC-MS/MS分析。4分析的证实4.1ms/ms分析分别将氯雷他定、地西泮储备液稀释成浓度为1.00μg·mL-1的溶液,采用蠕动泵以10μL·min-1的恒定速度泵入MS/MS系统,进行碎片离子分析,相应的二级全扫描质谱图见图1。4.2血浆样品测定分别取6名健康受试者的空白血浆[加入等体积甲醇-水(1∶1)代替内标溶液],对照品血浆和健康受试者口服氯雷他定片后的血浆样本,按“3”项方法处理,其典型色谱图示于图2。氯雷他定和地西泮的保留时间分别为2.45和1.85min,血浆中内源性物质在氯雷他定和内标地西泮出峰处均无杂峰。4.3内源性物质对氯雷他定和地西材料的基质效应因子的确定按“3”项方法处理6个不同来源空白血浆,得到空白血浆基质后,再加入低、中、高3个浓度的质控溶液及内标溶液,以其进样得到的峰面积除以相应浓度的质控溶液及内标溶液直接进样得到的峰面积,计算血浆中内源性物质对氯雷他定和地西泮的基质效应因子。血浆中内源性物质对低、中、高3个浓度的氯雷他定的基质效应因子分别为:(63.6±3.3)%,(68.5±2.4)%,(75.6±1.8)%,平均基质效应因子为(69.2±5.6)%,血浆内源性物质对内标地西泮的基质效应因子为(65.6±4.1)%。4.4方法的线性范围、标准曲线和方法检出限按“3”项方法处理对照品血浆,以血浆中待测物浓度为横坐标(X,ng·mL-1),待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标(Y),用加权(W=1/X2)最小二乘法进行回归运算,求得的直线回归方程为:Y=0.0822X-4.09×10-4(r=0.9991),本方法测定人血浆中氯雷他定浓度的线性范围为0.0300～40.0ng·mL-1。按“3”项方法处理浓度为0.0300ng·mL-1的对照品血浆,进行6样本分析,连续测定3d。根据当日的标准曲线,计算每一样本的浓度。结果见表1,批内、批间相对标准差(RSD)均小于15%,相对误差(RE)均在±15%的范围以内,本方法测定人血浆中氯雷他定浓度的定量下限为0.0300ng·mL-1。4.5质控样本测定按“3”项方法处理质控样本,每一浓度进行6样本分析,连续测定3d。根据当日的标准曲线,计算质控样本的测定浓度。准确度与精密度结果见表1,批内、批间RSD均小于15%,RE均在±15%的范围以内。4.6提取回收率的测定按“3”项方法处理低、中、高3个浓度的质控样本,以其进样得到的峰面积除以空白血浆经处理后再加入低、中、高3个浓度的质控溶液及内标溶液后进样得到的峰面积,计算血浆中氯雷他定和地西泮的提取回收率。血浆中低、中、高3个浓度的氯雷他定的提取回收率分别为:(89.0±7.0)%,(99.6±3.9)%,(92.7±3.5)%,平均提取回收率为(93.8±6.5)%,血浆中地西泮的提取回收率为(96.5±4.1)%。4.7氯雷他定的稳定性按“3”项方法处理质控样本,每一浓度进行3样本分析,考察血浆样本室温放置8h、经3次冻融、-80℃冰冻放置26d,以及血浆样本经处理后于自动进样器中室温放置9h后氯雷他定的稳定性。结果见表2,测定浓度与理论浓度的RE均在±9%以内,表明在血浆样本室温放置、反复冻融、长期冰冻放置过程中,以及处理后分析测定过程中,氯雷他定均较为稳定,各种贮存条件不影响对样本浓度进行准确测定。此外,氯雷他定储备液、内标溶液于4℃放置32d,以及内标溶液于室温放置24h均稳定。5生物等效研究5.1分组、治疗和随访22名中国健康男性受试者,年龄(24±3)岁,体重(60.9±5.3)kg,身高(1.72±0.05)m,体重指数(20±1)kg·m-2。试验前进行病史询问和体格检查,血常规、尿常规、肝肾功能及心电图检查等均正常。受试者试验前2周及试验期间未服用任何药物,试验期间禁烟酒或含咖啡因的饮料。受试者了解试验目的、方法、意义以及可能发生的不良反应后签署知情同意书。试验方案经航天中心医院医学伦理委员会批准。5.2氯雷他定片药物治疗本研究采用双周期2制剂交叉试验设计,22名受试者随机分为2组,交叉服用受试制剂和参比制剂,清洗期为10d。受试者隔夜禁食后,于试验当日清晨8:00空腹口服氯雷他定片受试制剂或参比制剂,剂量均为10mg,用200mL温开水送服。服药2h后统一饮水,4h后统一进低脂清淡饮食。于受试者服药前(0h)和服药后0.17,0.33,0.50,0.75,1,1.25,1.5,1.75,2,4,6,10,24,36,48h于上肢静脉取血约4mL置于肝素化试管中,2500r·min-1离心10min,取血浆,立即置于-80℃冰箱中保存备测。5.3血药浓度结果应用本研究中建立的LC-MS/MS法测定22名受试者口服受试制剂和参比制剂后不同时间血浆氯雷他定浓度,平均血药浓度-时间曲线见图3。采用DAS2.1.1软件、非房室模型方法计算各主要药动学参数,结果见表3。5.4氯雷他定片与参比制剂间auc0t的比较表5相对生物利用度(F)=(AUC受试制剂/AUC参比制剂)×100%,以上述公式分别计算每名受试者口服氯雷他定片受试制剂相对于参比制剂的相对生物利用度,然后计算平均相对生物利用度。氯雷他定片受试制剂相对于参比制剂的平均相对生物利用度为(100.5±34.1)%(以AUC0～t计),(101.7±34.8)%(以AUC0～∞计)。将AUC0～t,AUC0～∞和Cmax经对数转换后进行方差分析、双向单侧t检验和90%置信区间计算,将Tmax进行配对Wilcoxon法检验。结果表明,氯雷他定片受试制剂和参比制剂间AUC0～t,AUC0～∞,Cmax差异无统计学意义;受试制剂的AUC0～t,AUC0～∞,Cmax没有超过规定的参比制剂的高限和低限;受试制剂和参比制剂的AUC0～t和AUC0～∞几何均数比值分别为94.9%和95.8%,90%置信区间分别为85.3%～105.7%和85.8%～107.0%,在80%～125%的范围内,受试制剂和参比制剂的Cmax几何均数比值为90.8%,90%置信区间为75.6%～109.0%,在70%～143%的范围内;受试制剂和参比制剂间Tmax差异无统计学意义。因此,受试制剂与参比制剂具有生物等效性。质谱条件的影响本研究建立了测定人血浆氯雷他定浓度的LC-MS/MS方法。在血浆样本的处理方面,考察了碱化试剂NaOH的浓度对提取回收率的影响,结果表明,每500μL血浆样本使用浓度为0.5mol·L-1的NaOH100μL进行碱化,可在确保氯雷他定稳定的同时,通过一次简单的液-液萃取,使提取回收率达到90%以上,且重现性好。通过优化色谱条件和质谱条件,不仅缩短检测时间,减少血浆样本中基质对氯雷他定和内标地西泮测定的影响,同时增加方法的灵敏度,扩大定量范围,减少血浆用量。另外,氯雷他定在体内主要经CYP3A4和CYP2D6代谢,其体内暴露量(Cmax和AUC)受CYP3A4和CYP2D6遗传多态性的影响较大,存在显著的个体间差异(图3和表3均有显示),而氯雷他定口服制剂的临床单次常用剂量为10mg,应首选该剂量进行人体生物等效性研究,并且测定方法的LLOQ至少应达到