高效液相色谱串联质谱法测定人血浆中氯沙坦氢氯噻嗪

高效液相色谱串联质谱法测定人血浆中氯沙坦氢氯噻嗪

氯磺酸-氢氯仿铵是第一个血管紧张素（ang）的受体阻滞剂和尿剂的联合制剂。氯沙坦和氢氯噻嗪的降压作用叠加,二者合用时,能削弱氢氯噻嗪因刺激肾素-血管紧张素-醛固酮系统而产生的对抗血压调节的作用,AngⅡ受体选择性地被阻断的同时,利尿剂的降压作用可得到增强,且副作用降低。所以氯沙坦钾/氢氯噻嗪复方制剂在临床上适用于联合用药的高血压患者,以及重度高血压患者的初期治疗。本实验用HPLC-MS/MS法对氯沙坦钾和氢氯噻嗪进行分别测定,对20名健康男性志愿者口服氯沙坦钾氢氯噻嗪参比和受试制剂后的药物动力学进行了研究,以便为临床用药提供参考。材料、对象和方法1氯沙坦钾和氢氯噻嗪的对照品受试制剂:氯沙坦钾氢氯噻嗪片,规格:每片含氯沙坦钾50mg、氢氯噻嗪每片12.5mg,批号:050506,北京双吉制药有限公司生产;参比制剂:氯沙坦钾氢氯噻嗪片(商品名:海捷亚),规格:每片含氯沙坦钾50mg、氢氯噻嗪每片12.5mg,批号:S1170,MerckSharp&DohmeLtd.(UK)生产;氯沙坦钾和氢氯噻嗪的对照品(99.8%);内标:布洛芬对照品,含量:99.6%,均由北京双吉制药有限公司提供;替米沙坦对照品,含量:99.6%,北京万生药业有限公司提供。甲醇、乙腈、甲酸、氨水、乙醚,色谱纯,均为迪马公司提供;水为双重蒸馏水;空白血浆,沈阳军区总医院提供。1100液相系统,包括G1311A四元输液泵、G1313A自动进样器、G1316A柱温箱和G1379A脱气机,美国安捷伦公司产品;API2000三重四极杆串联质谱仪,配备电喷雾离子源、Analyst1.4.1软件,均为美国AppliedBiosystems公司产品;BS124SSartorius电子天平,北京赛多利斯仪器系统有限公司产品;TGL-16G离心沉淀机,上海安亭科学仪器厂产品;XW-80涡旋混合器,上海手术器械厂产品。DAS1.0统计计算软件,中国药理学会。2试验前后的体质量选择健康男性志愿受试者20名,年龄为21～25岁,身高156～180cm,体质量在标准体质量的±10%内。无继往病史和药物过敏史,精神状态良好,平时很少服药,不吸烟,不嗜酒,试验前2周内未服用任何药物。试验前后,接受全面体检(包括血常规、肝、肾功能及心电图检查),结果均属正常。受试者于试验前签署知情同意书。3饮食、饮食试验试验方案由辽宁中医药大学附属第二医院伦理委员会批准。隔夜禁食12h后,于次日早晨空腹单次口服氯沙坦钾氢氯噻嗪片(氯沙坦钾50mg、氢氯噻嗪每片12.5mg),用温开水200mL吞服。试验期间统一饮食;试验期间,禁止抽烟喝酒和剧烈运动,并不得使用其他任何药物及大蒜葱等有抑菌作用的食品;服药后2h,进食统一标准餐。分别于服药前及服药后0.33、0.67、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、10、12、24、36h,由肘正中静脉取血5mL,并立即移入经肝素处理的离心试管中,3500r·min-1离心10min,分离血浆,于-20℃冰箱保存待测。4铬和铬的形成4.1水质条件:3.2色谱柱:ZobaxXDB-C18色谱柱(150mm×4.6mm,5μm);流动相为甲醇-1%甲酸(80∶20);流量:0.5mL·min-1;柱温25℃;进样:10μL。质谱条件:离子源为电喷雾电离源(TurboIonspray);正离子方式检测;扫描方式为多反应监测(MRM),碰撞能量(CE)分别为30eV(氯沙坦)和50eV(替米沙坦);用于定量分析的离子反应分别为m/z423→m/z207(氯沙坦)和m/z515→m/z276(替米沙坦),扫描时间为0.2s。4.2质谱条件色谱柱:ZobaxXDB-C18色谱柱(150mm×4.6mm,5μm);流动相为乙腈-2%氨水(80∶20);流量0.5mL·min-1;柱温25℃;进样:10μL。质谱条件:离子源为电喷雾电离源(TurboIonspray);负离子方式检测;扫描方式为多反应监测(MRM),碰撞能量(CE)分别为-28eV(氢氯噻嗪)和-10eV(布洛芬);用于定量分析的离子反应分别为m/z296.0→m/z204.9(氢氯噻嗪)和m/z205.1→m/z161.0(布洛芬),扫描时间为0.2s。5lc/ms分析氯沙坦取血浆200μL,分别加入甲醇50μL,内标溶液50μL(200ng·mL-1替米沙坦溶液)和1%甲酸50μL,混匀;加乙醚6mL,涡流混合1min,10000r·min-1离心5min;取上清液于另一试管中,40℃氮气流下吹干,残留物加入流动相100μL溶解,涡流混合,取10μL进行LC/MS/MS分析。氢氯噻嗪取血浆200μL,分别加入流动相50μL,内标溶液50μL(100ng·mL-1布洛芬溶液),涡流混合1min;加乙醚5mL,涡流混合2min,10000r·min-1离心5min;分取上层有机相于另一试管中,于40℃氮气流下吹干,残留物加入流动相100μL溶解,涡流混合,取20μL进行LC/MS/MS分析。结果1方法学评价1.1内标布洛芬和氯沙坦的保留时间用内标法进行测定,本试验条件下,测得色谱图见图1、2。由图1、2可见,血浆中氯沙坦和内标替米沙坦的保留时间分别为2.53、2.00min;氢氯噻嗪和内标布洛芬的保留时间分别为2.5、2.05min。表明空白血浆中内源性物质不干扰测定。1.2标准曲线和回归方程氯沙坦取空白血浆200μL,加氯沙坦标准溶液50μL,配制成相当于氯沙坦血浆浓度为5、10、20、50、100、200和400ng·mL-1的样品,按上述方法操作,每一浓度进行双样本分析,进样10μL;以待测物浓度为横坐标、待测物与内标物峰面积比值为纵坐标,用加权(W=1/X2)最小二乘法进行回归运算,求得直线回归方程为Y=1.74×10-2X+1.06×10-2(γ=0.9982);定量下限为5.0ng·mL-1。氢氯噻嗪取空白血浆200μL,加标准系列溶液50μL,配制成相当于氢氯噻嗪血浆浓度为1、2、5、10、20、50和100ng·mL-1的样品,按上述方法操作,每一浓度进行双样本分析,进样20μL;以待测物浓度为横坐标、待测物与内标物峰面积比值为纵坐标,用加权(W=1/X2)最小二乘法进行回归运算,求得直线回归方程为Y=2.72×10-3X+1.14×10-3(γ=0.9988);定量下限为1.0ng·mL-1。1.3准确度、精密度和回收率取空白血浆,配置氯沙坦低、中、高3个浓度(10、50和320ng·mL-1)的质控样品和氢氯噻嗪低、中、高3个浓度(2、20和80ng·mL-1)的质控样品,每一浓度进行6样本分析,连续测定3d,根据当日标准曲线,求得准确度与日内、日间精密度,结果见表1。以提取后的色谱峰面积与空白血浆提取后加入对照品溶液进样获得的色谱峰面积之比,考察方法的提取回收率,结果见表2。内标物提取回收率试验方法相同,提取回收率均>60%。1.4萃取药物稳定性的测定取空白血浆,配制氯沙坦和氢氯噻嗪的低、中、高3个浓度的质控样品,每浓度3样本分析,考察药物的稳定性。结果表明,氯沙坦血浆样品经液液萃取处理后,室温放置12h;经2次冷冻-解冻循环,-20℃保存15天稳定;氢氯噻嗪血浆样品经液液萃取处理后,室温放置12h,经2次冷冻-解冻循环,-20℃保存15天稳定。2服药时间曲线20名健康受试者口服受试制剂和参比制剂(氯沙坦钾50mg、氢氯噻嗪12.5mg)后,平均血药浓度-时间曲线,见图3。3药房动态参数用梯形法计算AUC,以半对数作图法由消除相浓度点计算t1/2;tmax和Cmax用实测值,结果见表3。4生物利用度测定结果20名受试者口服含氯沙坦钾50mg、氢氯噻嗪12.5mg的受试制剂和参比制剂后氯沙坦相对生物利用度平均为(96.5±21.2)%,方差分析结果表明,受试制剂与参比制剂相比,生物利用度无显著性差异,受试制剂AUC0-t的90%置信区间为参比制剂相应参数的86.0%～103.2%。氢氯噻嗪的相对生物利用度平均为(106.8±22.9)%,方差分析结果表明,受试制剂与参比制剂相比,生物利用度无显著性差异,受试制剂AUC0-t的90%置信区间为参比制剂相应参数的96.3%～113.5%,表明2种制剂具有生物等效性。流动相条件存在的灵敏度氯沙坦正离子电离方式下有强吸收;而氢氯噻嗪在正离子电离方式下无质谱响应。氢氯噻嗪在负离子电离方式下有较强的吸收;而氯沙坦在负离子电离方式下强度很弱,因此选择分别用2种离子模式对氯沙坦、氢氯噻嗪进行测定。由于氯沙坦在正离子电离方式下进行测定,因此在流动相中加入适量甲酸能明显提高灵敏度;同样,氢氯噻嗪在负离子电离方式下进行测定,在流动相中加入适量氨水,使其灵敏度较同样不加氨水条件下峰型和灵敏度均得到明显改善,增加了实验结果的稳定性和可靠性。将主要药代动力学参数经对数转换后进行方差分析,结果显示,受试制剂和参比制剂中氯沙坦和氢氯噻