中医热毒血瘀证表征大鼠血管内皮细胞损伤和血小板功能的病理变化

中医热毒血瘀证表征大鼠血管内皮细胞损伤和血小板功能的病理变化

热毒血瘀证是中医学热毒阻滞（血液）的常见症候。热盛伤津耗液使血液黏稠,热盛灼伤脉络使血行不利,热盛迫血妄行使血液离经,热盛阻遏气机以致气滞,这些过程均可导致血瘀。本课题组通过腹腔注射内毒素即脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),初步建立了热毒血瘀证大鼠模型。该模型较好地模拟了中医有关外邪入侵、热毒炽盛、热盛为毒、炼血成瘀的疾病演变过程,比较符合中医的热毒血瘀证形成理论;同时,该模型除展示出一系列类似中医热毒血瘀证的临床症状外,还提供了血液流变学、炎症因子、血脂变化等指标,为中医热毒血瘀证提供了部分客观生物医学依据。可以说,该模型较好地克服了既往热毒血瘀证动物模型稳定性差、存活时间短、模拟的症状不甚符合中医临床标准表现以及客观检测指标不够统一的缺点。因此,在该模型上进一步观察发掘生物医学指标对用现代医学观念理解血瘀证本质具有重要意义。血浆内皮素(ET)、热休克蛋白70(HSP70)、血栓烷B2(TXB2)和6-酮-前列腺素(6-Keto-PGF1α)是四种与血管内皮细胞(VEC)损伤和血小板活化密切相关的生物活性物质。其中,ET是目前已知的最强的血管收缩剂,是VEC损伤时表达的重要因子。HSP70具有重要的抗氧化损伤作用,反应了机体氧化应激反应的程度。血栓素A2(TXA2)由血小板产生,具有强烈的促血小板聚集和促血管收缩作用。前列环素(PGI2)由VEC合成,具有强烈的抑制血小板聚集和扩张血管的作用,代谢产物分别为TXB2和6-Keto-PGF1α,其比值可反应血小板活化情况。为此,本研究拟通过行为学分析、舌体组织血氧饱和度测定等进一步观察模型血浆ET、TXB2、6-Keto-PGF1α与中医热毒血瘀证的关系,探讨热毒血瘀证的现代病理生理基础。1动物分组、模型制备和局部血氧监护1.1实验材料SPF级雄性Sprague-Dewley(SD)大鼠,体重190g~210g,购于北京维通利华实验动物技术有限公司,动物许可证号为SCXK(京2002—0003)。脂多糖来源于菌株Escherichiacoli055:B5,购自美国SIGMA公司。数码摄像机选自日本SONY公司。动物行为轨迹分析软件购自EthoVision,version3.1,Noldus公司。ET放免药盒、6-Keto-PGF1α放免药盒及TXB2放免药盒购自解放军总医院科技开发中心放免所。计数器选自西安凯普机电有限责任公司,型号FM-2000。HSP70酶标免疫药盒购自USCNLIFESCIENCE&TECHNOLOGYCOMPANY,选用ThermoLabsystems酶标仪,型号:MultiskanMK3。ODISseyTM局部组织血氧监护仪由北京中沃科技有限公司提供。1.2动物模型制备LPS注射液用无热源生理盐水配制成,浓度为2.5mg/mL。SD大鼠108只,自由饮食、进水,按随机数字表法将动物分为模型组(60只)和正常组(48只)。模型组又随机分为注射LPS后3h、1d、1周、2周、4周及8周共6个时间点,每个时间点10只大鼠。分别于腹腔注射LPS(2.5mg/kg,2次/周)后不同时间点处死动物,处死前禁食12h,自由饮水,严格按照无菌操作规程从颈总动脉取血,分血清生化管(非抗凝)存放。模型组各时间点分别设置正常组8只大鼠,腹腔注射无热源生理盐水2.5mg/kg(2次/周),分别腹腔注射生理盐水后与模型组相对应的时间点同步处死动物,取血。1.3行为学分析给药后1周、2周、4周、8周各记录大鼠行为轨迹。将大鼠放置于相同的无盖盒子内(30cm×30cm),5min后用SONY数码摄像机从盒子上方记录大鼠在30min内的活动情况,使用动物行为轨迹分析软件测得大鼠30min内在盒子内的运动距离(cm)和平均速度(cm/s),图像采集6桢/秒。记录均在10:00进行。1.4舌体组织血氧饱和度测定大鼠在不同时间点处死前1d,用0.6%水合氯醛溶液,按100g体重0.6mL腹腔注射麻醉,在室温环境下,将大鼠仰卧置于操作台上,将舌体轻轻拉出,以组织血氧测量仪的探头固定于大鼠舌体中部,压力以刚好接触舌体为度,接触面积达80%以上为标准,记录当时的血氧饱和度值。1.5血浆检测指标放射性免疫学方法检测各时间点血浆ET、6-Keto-PGF1α、TXB2;酶联免疫学方法检测HSP70。1.6统计学处理采用SPSS11.5统计学软件处理数据。计量资料以均数±标准差(x¯±s)(x¯±s)表示,采用t检验。2结果2.1模型大鼠运动速度和组织血氧饱和度模型组给药后2周、4周、8周大鼠30min内在盒内的运动距离与正常组相比均有所减少(P<0.05);给药后1周、2周、4周、8周模型组大鼠平均运动速度与正常组相比明星降低(P<0.05或P<0.01);模型组大鼠的运动距离和平均速度随时间推移逐渐变小。给药后8周模型组大鼠舌体组织血氧饱和度较正常组显著降低(P<0.01)。模型组大鼠的舌体组织血氧饱和度随时间推移逐渐降低。详见表1。2.2给药后大鼠血清6-keto-pgf1和txb2表达变化给药3h模型组大鼠血清ET的浓度与正常组相比显著升高(P<0.01),给药1d、1周、2周模型组大鼠血清HSP70的浓度与正常组相比升高明显(P<0.05或P<0.01)。给药后1d、2周模型组大鼠血清6-Keto-PGF1α浓度与正常组相比降低(P<0.05),而TXB2与正常组相比则升高(P<0.05);给药后8周模型组大鼠血清6-Keto-PGF1α浓度与正常组相比升高(P<0.01);给药后1d、2周模型组大鼠TXB2/6-Keto-PGF1α与正常组相比升高(P<0.05),8周时与正常组相比则降低(P<0.05)。详见表2。3中医热毒瘀证模型的现代意义中医认为,热毒炽盛是热毒血瘀证形成的基本病因。热邪深入营血分,化火成毒,灼伤阴血,炼熬血液,脏腑脉络受损,进而导致热瘀交结的病理状态。由LPS引发的持续内毒素血症,可以导致组织器官的缺血、缺氧、血循环障碍等方面的异常。根据中医理论,内毒素应属热邪、毒邪因素,故持续注射一定时间后,大鼠即表现出很类似中医血瘀证的症状,如体重增加缓慢、进食下降并活动减少、皮毛变得枯黄、爪甲由淡粉色变枯燥、尾部光泽减退并逐渐呈紫暗色、眼睛分泌物增多、大便臭秽、多处于闭目无精神状。从中医注重的舌象来看,可以看到大鼠舌质从最初红润逐渐变暗,津液减少,舌下静脉变长。血液流变学检测则发现1周~4周血液黏度及红细胞功能有改变,4周~8周血小板聚集增强伴血浆黏度升高,特别是血脂升高。鉴于魏海峰等已经证实测定舌体组织血氧饱和度是评价血瘀证舌暗的有效方法,因此,在本实验中通过行为学分析和测定舌体组织血氧饱和度对以前获得的表征进一步进行了量化,发现注射LPS的模型大鼠的运动距离、速度显著下降,它们的舌体组织血氧饱和度随时间推移逐渐下降,在8周时下降特别明显,这与通过舌像摄影所获得的结果基本一致,和大鼠的运动距离、速度也存在一定相关性。本研究从病因、表征、血液流变学不同方面进一步说明我们以往建立的中医热毒血瘀证大鼠模型是符合中医理念的,能够较好地模拟中医热毒血瘀证慢性发展变化的过程。也就是说,从该模型身上进一步挖掘各种现代生物医学指标应该能深入解密中医热毒血瘀证的现代医学含义。血管和血液应该是考虑炎症与血瘀证关系的重要靶点。在LPS刺激下,VEC大量分泌白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等炎性细胞因子,它们可作用于体温调节中枢引起发热;TNF-α、IL-1还可刺激VEC和白细胞释放一系列炎性介质(如NO、氧自由基等),通过协同作用改变凝血功能,导致组织损伤及弥漫性血管内凝血,故在感染性休克中起重要作用。LPS作用于VEC还可迅速引起细胞骨架蛋白的解聚和重组,细胞与细胞间、细胞与基底膜间的黏附连接松解,形成细胞间隙,导致微血管通透性升高。VEC的存在为维持正常血液流动状态所必需,其损伤可造成许多疾病发生发展,特别是血管性疾病。本研究结果显示,腹腔注射LPS3h后模型大鼠血浆ET浓度显著升高,这说明VEC有受损现象。因为VEC受损可表现分泌功能异常及血管通透性改变,进而会引发血液成分、血流变特性和血小板功能的改变;类似血浆ET升高的现象也能在血瘀证患者中看到。这说明,现代生物医学所看到的内皮细胞损伤表现与中医的血瘀证有密切相关性。许多人认为,中医学所认识有关“络”的概念在形态、功能上都和现代医学微小血管的概念有相通之处,故可以认为VEC的损伤与“络病”的发生关系密切。这也反过来说明用LPS来损伤VEC以复制热毒血瘀模型是可行的,符合热毒血瘀证的“热毒伤络”病机。随后的1周~8周则未检测到ET的显著性变化,这可能是大鼠对内毒素有耐受的结果。尽管体内ET变化不明显,但在LPS反复作用下,VEC损伤应该持续存在。同时,在1d、1周、2周时模型组大鼠血清HSP70的浓度升高,说明模型在该时间段内存在较强的氧化应激反应,并可能造成VEC的急性损伤。本模型的炎症反应和VEC损伤可能互为因果,成为致瘀的始动因素。自由基、炎症介质、内毒素等致病因素均可作用于VEC,引起其功能失衡及通透性变化,促成微血栓形成,引发或加重血管损伤及循环障碍,即所谓“邪热伤络,血溢致瘀”。由内毒素使机体释放的多种炎症介质可在内皮和单核细胞表面诱导组织因子(TF)的表达,这又可以启动凝血,内皮细胞受损、内皮下胶原暴露也能启动内源性凝血途径,引起血小板活化,促进血栓形成。生理状态下,TXA2及PGI2两者保持一定的比例,维持血液循环的稳定。在病理情况下,血小板产生的TXA2明显减少或VEC产生的PGI2相对过多,就会导致出血倾向;反之,PGI2分泌减少,TXA2增多则可导致血管痉挛加重,血栓形成加速,后者又继发性激活血小板,催化释放肾上腺素,反馈加速血小板聚集和血栓形成。已有研究发现,血瘀证与血浆TXA2-PGI2平衡失调密切相关。本研究1d、2周时TXB2/6-Keto-PGF1α显著升高、8周时显著降低,表明早期模型大鼠在炎症、氧化应激和内皮细胞损伤多种因素刺激下有血小板活化,导致血管收缩、微循环中血小板黏附聚集而阻滞血流;后期则可能有体内微循环障碍、血栓形成、血小板活化程度下降,一方面使血管扩张、通透性增加,另一方面