流动相离子强度对反相高效液相色谱峰形的影响

流动相离子强度对反相高效液相色谱峰形的影响

据统计，约80%的药物含有碱性官能团，因此，碱性抗剂的逆相高效液相铬（ep-hplc）的行为在铬学术界是一个吸引人的研究主题。然而，具有不同父母准父母碱活性物质（ep-hplc）的分离重要性越来越受到重视。然而,由于碱性化合物的保留可随着流动相pH值的不同而产生显著的变化,因而它们的RP-HPLC分离通常具有一定的难度。在某些pH范围内,碱性化合物的色谱峰拖尾,表观柱效(理论板数,n)较低,其原因可能包括色谱柱的过载、碱性化合物与填料表面残余硅醇基的相互作用以及较慢的吸附-解吸附动力学等。绝大多数抗生素同时含有碱性和酸性基团,多为亲水性的两性化合物,故其RP-HPLC行为远较通常的碱性化合物更为复杂。我们在应用现行各国药典进行抗生素RP-HPLC分析时发现,有些抗生素的色谱峰形异常——峰形展宽并接近直角三角形,色谱峰的拖尾因子及峰宽均较大,有时甚至影响到被测物与有关物质间的分离。囿于目前的填料制造水平,以硅胶为基质的反相键合相填料的表面实际上是不均匀的,固定相中不可避免地含有少量高能量位点(sites),这些高能量位点易为可解离的(甚至中性的)化合物所过载(overloading)。此外,解离的化合物在固定相表面的相互排斥作用以及较难渗透进入疏水性的固定相中也是可能的原因。众多实验结果已经证实,在线性色谱(linearchromatography)领域,采用RP-HPLC分离可解离的(尤其是碱性的)化合物时色谱柱易于过载,甚至低达10ng(相当于10-6,进样10μl)的碱性化合物也可使常规色谱柱(150mm×4.6mm)的表观柱效明显降低;减少进样量则可改善色谱峰形并使表观柱效显著增加;过载效应可随着流动相的离子强度(c)的增加而逐渐减弱。本课题选取了几个具有代表性的抗生素品种,初步研究了流动相的离子强度对RP-HPLC中抗生素色谱峰形的影响。1lbkgelods-100s美国Agilent1100型HPLC仪。色谱柱:头孢呋辛为美国DiscoveryC18(250mm×4.6mm,5μm),头孢哌酮和青霉素G为英国HypersilBDSC18(250mm×4.0mm,5μm),克林霉素为日本TSKGELODS-100S(150mm×4.6mm,5μm)。头孢呋辛钠、头孢哌酮钠、头孢哌酮S异构体、头孢哌酮降解物B、盐酸克林霉素和青霉素G钾对照品均由中国药品生物制品检定所提供。乙酸钠、乙酸、氯化钠、氢氧化锂、氢氧化钾、氨水、甲酸钠、甲酸、三乙胺、磷酸二氢钾、磷酸二氢铵、磷酸和高氯酸钠均为分析纯,乙腈和甲醇均为HPLC级,水为蒸馏水。应用PeakMaster5.1软件(Charles大学)计算流动相的离子强度。2克林激素-a-cor-3,4-吡啶苏-1,5,10.流动相的组成以及供试品液的浓度见结果与讨论;检测波长:头孢呋辛和头孢哌酮为254nm,克林霉素为214nm,青霉素G为220nm;柱温30℃。流速:头孢呋辛为1.5ml/min,头孢哌酮为1.2ml/min,克林霉素和青霉素G为1.0ml/min。进样体积:头孢呋辛为20μl,头孢哌酮、克林霉素和青霉素G为10μl。以流动相作头孢呋辛钠、头孢哌酮钠和盐酸克林霉素的溶剂,以水作青霉素G钾的溶剂。3硅醇基的选择已知在低pH值的流动相中,以所谓“B型”高纯度硅胶为基质的反相键合相填料的表面几乎不存在离子化的硅醇基,这使得残余硅醇基对被测物的保留和过载行为的影响极小,故本课题主要采用这类金属残留量极低、酸性硅醇基含量最少的惰性填料——DiscoveryC18、HypersilBDSC18和TSKGELODS-100S。3.1色谱柱的选择中国药典(ChP)[2a]测定头孢呋辛钠中头孢呋辛含量的RP-HPLC系统是参考美国药典(USP)和英国药典(BP)[3a,4a]制订的,主要区别在于ChP选用C18柱代替USP规定的己基硅烷键合硅胶(C6)柱,而流动相则均为乙腈∶pH3.4乙酸盐缓冲液(含5mmol/L乙酸钠和0.1mol/L乙酸)(1∶10),头孢呋辛(羧基的pKa值为2.5)在流动相中大部分呈解离状态并荷负电。由于ChP规定采用较大的进样量(0.5mg/ml,约1.1mmol/L,20μl),使头孢呋辛峰具有典型的过载特征[5,6,7,8,9,10,11,12,14]——峰形接近直角三角形。随着进样量的增加,色谱区带中高浓度(C)的前半部的保留时间(tR)相应减少,但色谱区带均在同一时刻结束(Fig.1A,Tab.1)。这种色谱峰形在色谱学界通常称之为过载拖尾(overloadtailing)或非线性拖尾(nonlineartailing)。过载使头孢呋辛峰的拖尾因子(T)和峰宽均显著增加,头孢呋辛与有关物质间的分离也相应变差。另选用其他C18柱(KromasilC18、ZorbaxC18、InertsilODS-3、HypersilBDSC18、TSKGELODS-100S、ShimpackCLC-ODS和LiChrospher100RP18e)、C8柱(KromasilC8、InertsilC8-3、HypersilBDSC8、ShimpackCLC-C8、TSKGELC8和DiscoveryC8)和C4柱(SinoChromC4)实验,结果也如此。如选用C6柱则可得最为对称的色谱峰形,且头孢呋辛峰无过载特征(Fig.1B)。国内另有研究表明,头孢呋辛的峰形与填料的品牌也即填料的制造工艺有关,选用某些品牌的填料如SpherisorbC18可得较为对称的峰形,在我们的实验中也得到证实。由此可见,虽然所用流动相的缓冲容量较低(乙酸的pKa值约为4.7[17a]),但头孢呋辛在大多数类型的色谱柱上易于过载并非由于缓冲液过载(bufferoverload)所致,而可能源于这类色谱柱对离子化的化合物的饱和容量相对较低。最近的研究结果[7,8,9,10,11,12,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27]显示,应用RP-HPLC分离可解离的化合物时,流动相中添加缓冲盐并非仅仅用于稳定流动相的pH值,缓冲盐、甚至简单的中性盐的反离子还可与离子化的被测物通过相互间的缔合作用形成疏水性较强的中性离子对复合物;在低离子强度的缓冲液中,吸附在固定相表面的离子化的被测物分子的极性基团相互之间存在静电排斥效应,这使得色谱柱的饱和容量显著降低;随着缓冲液浓度(离子强度)的增加,中性离子对复合物的浓度相应增加,固定相表面离子化的吸附物之间的相互排斥作用随之减弱,导致色谱柱的饱和容量、尤其是填料上的低能量位点(与溶质和键合相的烷基链之间的相互扩散作用有关)的饱和容量以及平衡常数增加;盐一类的流动相添加剂可破坏离子化的被测物在流动相中的溶剂化-去溶剂化平衡,产生所谓的促溶效应(chaotropiceffect),被测物与盐相互作用,离子化的被测物相互间的排斥作用减弱,从而显著地影响被测物在固定相上的吸附行为;在制备色谱系统中或被测物浓度较高时,流动相中应含有足量的缓冲盐以改善色谱峰形和分离效果。根据文献[8,9,10,11,12,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27],在流动相中添加中性盐如氯化钠或增加缓冲液的浓度(均使离子强度增加)后,头孢呋辛的峰形显著改善,拖尾因子降低,表观柱效增加,其保留时间受进样量的影响变小,且缓冲液的浓度越高,效果越明显。有研究表明,色谱柱的饱和容量可随缓冲盐的单价阳离子(如Na+、K+、Cs+)直径的增加而降低,故分别以NH+4、K+、Li+代替Na+进行了实验。选用Na+,色谱柱的饱和容量相对较高。流动相中如含10%乙腈,则乙酸的pKa值可由4.7增至4.9;流动相的表观pH值通常可随着乙腈浓度的增加而相应增加,且表观pH值的变化与缓冲盐的种类、浓度以及最初的pH值等均相关。显然,现行药典的流动相的缓冲容量较低,流动相中的乙酸只有极少量以解离的形式存在,如欲增加缓冲液的浓度,则缓冲液中需添加高浓度的乙酸,这使得乙酸可能作为强洗脱剂成分,改变色谱系统的选择性。因此,缓冲盐改用与乙酸性质类似但更为适宜的甲酸盐(pKa值约为3.7[17b]),同时流动相进一步优化为乙腈∶pH3.4甲酸盐缓冲液(含80mmol/L甲酸钠和0.14mol/L甲酸)(1∶9),则可得较好的色谱峰形(Fig.1C)。另用其他C18柱(KromasilC18、HypersilBDSC18和TSKGELODS-100S)实验,亦可得显著改善的色谱峰形。众所周知,保留值(如容量因子k)反映了被测物在固定相和流动相中的量之比,故过载行为对保留值较大的组分更易于发生。实验结果也证实,随着流动相中乙腈浓度的增加,头孢呋辛的保留时间减少,色谱峰的对称性进一步改善(乙腈浓度为15%时,理论板数不增反降则是由于保留时间较少时,表观柱效受柱前死体积的影响相对较大所致)。3.2色谱系统平衡所需时间的稳定性ChP[2b]测定头孢哌酮钠中头孢哌酮含量的RP-HPLC系统是参考USP[3b]制订的,ChP和USP的流动相均为乙腈∶pH4.4乙酸盐缓冲液(含1.2mmol/L三乙胺和4mmol/L乙酸)(12∶88);BP[4b]的流动相为乙腈∶pH4.4乙酸盐缓冲液(含2.5mmol/L三乙胺和6mmol/L乙酸)(11∶89)。ChP采用较大的进样量(0.5mg/ml,约0.7mmol/L,10μl),头孢哌酮及其S异构体的色谱峰均具有典型的过载特征,降解物B(中性化合物)的峰形则非常对称(Fig.2A)。另选用其他C18柱(KromasilC18、InertsilODS-3、TSKGELODS-100S和LiChrospher100RP18e)实验,结果也如此。国内许多实验室证实,ChP方法对色谱柱的要求比较苛刻,即使降低进样量也仅有少数品牌的色谱柱符合国外药典对系统适用性的要求(USP:T≤1.5,BP:n≥5000);选用BP流动相则色谱柱的选择范围相对较宽;ChP色谱系统的平衡所需时间较长;采用某些品牌的色谱柱,头孢哌酮的保留时间的重现性较差;选用不同品牌的填料,头孢哌酮及其主要杂质的洗脱顺序可能不同。三乙胺在HPLC早期主要作为扫尾剂以改善色谱峰形,随着最近十多年来填料制造工艺的改进以及所谓惰性填料的广泛应用,三乙胺在现代HPLC中已很少采用。三乙胺在ChP色谱系统中还可作为疏水性较弱的离子对试剂影响头孢哌酮的保留,随着流动相中三乙胺浓度的增加,头孢哌酮的保留时间相应减少。流动相中离子对试剂的浓度一般应不低于5mmol/L,否则色谱系统的平衡所需时间较长,且离子化的化合物的保留值的重现性可能较差。采用无缓冲液或缓冲容量极低的流动相时,可解离的化合物的色谱峰可随着进样量的增加而展宽甚至裂分。在含12%～18%乙腈的流动相中,乙酸的pKa值由4.7增至约5.1。显然,ChP色谱系统的缓冲容量极低,缓冲液的浓度与供试品液的浓度接近,较高浓度的供试品液进入色谱系统后,头孢哌酮在流动相中的二次化学平衡会导致色谱区带处的流动相pH值发生微小变化,影响头孢哌酮的可解离基团的离子化,即头孢哌酮在色谱区带的每一点处的离子化程度取决于其本身的浓度,而头孢哌酮的不同离子化形式的保留是不同的,结果导致缓冲液过载——头孢哌酮峰展宽,保留值重现性差。如采用1/10的进样量,则头孢哌酮的峰形显著改善,但仍呈现过载特征,仍较难符合国外药典的要求。在流动相中添加中性盐后,头孢哌酮的峰形显著改善,拖尾因子和峰宽均降低,其保留时间受进样量的影响变小,且盐的浓度越高,效果越明显。参考ChP2005和文献,将乙酸盐缓冲液的pH值降至3.0,虽然离子强度仅稍增加,但头孢哌酮的峰形显著改善,只是仍稍具过载特征(Fig.2B)。这是因为在含有乙腈的流动相中,化合物的酸性基团的pKa值会随着乙腈浓度的增加而相应增加,故pH3.0时,头孢哌酮的羧基[pKa值为2.3(/drug/01/010103.htm)]在流动相中的解离被抑制,吸附在固定相表面的、羧基解离的头孢哌酮分子显著减少,头孢哌酮分子相互间的静电排斥效应相应降低,使色谱柱的容量、表观柱效以及头孢哌酮的保留时间均随之增加。鉴于ChP2005流动相的缓冲容量仍较低,流动相中的乙酸只有极少量以解离的形式存在,故缓冲盐改用更为适宜的甲酸盐,同时弃用会使保留机理复杂化的三乙胺,选用乙腈∶pH3.0甲酸盐缓冲液(含40mmol/L甲酸钠和0.18mol/L甲酸)(18∶82)为流动相时,可得较好的色谱峰形和分离效果(Fig.2C);随着缓冲液浓度的进一步增加,色谱峰形进一步改善;甚至进样量增加1倍,也未见拖尾因子和峰宽有显著的增加。另用其他C18柱(KromasilC18、LiChrospher100RP18e、DiscoveryC18、HypersilBDSC18和TSKGELODS-100S)实验,亦可得显著改善的色谱峰形和分离效果。但值得注意并令人困惑的是,仅仅将乙酸盐缓冲液的pH值降至3.0并添加约16mmol/LNaCl,却可得最佳的色谱峰形。3.3流动相的离子强度ChP[2c]测定盐酸克林霉素中克林霉素含量的RP-HPLC系统与BP和USP[3b,4b]不同,ChP的流动相为甲醇∶pH3.0磷酸盐缓冲液(含25mmol/L磷酸二氢铵+4mmol/L磷酸)(45∶55),BP和USP的流动相为乙腈∶pH7.5磷酸盐缓冲液(含50mmol/L磷酸二氢钾和40mmol/L氢氧化钾)(42∶58)。ChP采用与BP相同的进样量,但克林霉素峰具有典型的过载特征(Fig.3A)。另选用其他C18柱(KromasilC18、InertsilODS-3、HypersilBDSC18、DiscoveryC18、Shim-packCLC-ODS和LiChrospher100RP18e)实验,结果也如此。如选用BP的色谱系统,则克林霉素的峰形较为对称,表观柱效亦较高(Fig.3B)。参考BP的色谱系统,以甲醇代替乙腈,并适当增加甲醇的浓度以使克林霉素具有几乎相同的保留时间,则流动相的离子强度减半,拖尾因子和峰宽仅稍增加;在ChP的流动相中添加中性盐或缓冲液浓度增加1倍,拖尾因子显著降低,但表观柱效亦相应降低;如流动相的缓冲液浓度增加4倍,则峰形明显改善,拖尾因子和峰宽均降低,但色谱峰仍具有过载的特征(Fig.3C);如缓冲液浓度增加4倍并以乙腈代替甲醇,同时适当减少乙腈的浓度,流动相的离子强度增加近6倍,但峰形却未见显著改善。上述实验结果表明,克林霉素在固定相上的过载不仅仅与流动相的离子强度有关。在低pH值的流动相中,反相色谱柱易于为质子化的碱性化合物所过载;在色谱柱均过载的情形下,采用低pH值(pH2～3)流动相所得的色谱峰形明显不同于采用高pH值(pH7)流动相所得的色谱峰形,后者的峰形更复杂,后者同时还具有明显的指数拖尾(exponentialtailing)也即动力学拖尾(kinetictailing)的特征,提示在高pH值时除疏水相互作用外,还存在离子交换的相互作用;填料表面在高pH值流动相中出现阳离子交换位点,相应地增加了色谱柱的容量;流动相中反离子的化合价较高时(如BP流动相中的H2PO2−442-之于ChP流动相中的H2PO-4),反离子可与一个以上的有机离子形成中性离子对复合物,相应地减少了吸附在固定相表面的克林霉素分子及其相互间的静电排斥效应,增加色谱柱的饱和容量。此外,流动相中选用不同的有机溶剂,有可能影响固定相的构象以及被测物在固定相表面的吸附和分配,导致不同的色谱峰形。由于在含有乙腈或甲醇的流动相中,碱性化合物的pKa值通常可随着有机溶剂浓度的增加而逐渐降低,故克林霉素(pKa值为7.6)在BP流动相中只有少量以质子化的形式存在,因而吸附在固定相表面的离子化的克林霉素分子极少,克林霉素分子相互间的静电排斥效应较小,这使得色谱柱的饱和容量较高;克林霉素在ChP流动相中则全部是以质子化的形式存在的,故吸附在固定相表面的克林霉素分子均以离子化的形式存在,其相互间的静电排斥效应较大,致使色谱柱的饱和容量相应较低。磷酸盐(磷酸的pKa值为2.2,7.1,12.3[15c])在ChP流动相中主要以H2PO-4的形式存在。流动相中缓冲盐的种类不同,则色谱柱的饱和容量、色谱峰形以及表观柱效等均不相同;流动相中选用不同种类的无机反离子,质子化的碱性化合物峰的理论板数和拖尾因子均显著不同,在已测试的四种反离子中,使拖尾因子降低、表观柱效增加的趋势如下:六氟磷酸根(PF-6)>高氯酸根(ClO-4)>四硼磷酸根(BF-4)>H2PO-4。向ChP流动相的缓冲液中添加0.1mol/LNaClO4,虽然流动相的离子强度仅增加3倍,但克林霉素峰的拖尾因子显著降低,表观柱效和保留时间亦显著增加,唯克林霉素与紧邻的未知杂质的分离度并未如预计地显著增加,提示高浓度的ClO-4在该流动相中可能作为对离子改变了色谱系统的选择性。3.4色谱峰峰行为USP[4d]测定青霉素G钾中青霉素G含量的RP-HPLC系统与BP[3d]不同,USP的流动相为甲醇∶10mmol/L磷酸二氢钾溶液(40∶60),BP的流动相则为甲醇∶pH3.5磷酸盐缓冲液(80mmol/L磷酸二氢钾+3mmol/L磷酸)(35∶65)。USP的进样量是BP的进样量的1/20,选用USP的流动相和进样量,青霉素G峰形比较对称,增加进样量则峰形具有过载的特征(Fig.4A)。另选用其他C18柱(KromasilC18、InertsilODS-3和TSKGELODS-100S)实验,结果也如此。改用BP的流动相,青霉素G峰形对称且几乎不受进样量大小的影响。如将USP的流动相中的磷酸二氢钾浓度增至50mmol/L,同时甲醇浓度增至50%,则峰形显著改善,但仍稍具过载特征(Fig.4B);继用磷酸调节磷酸二氢钾溶液的pH值至3.5,则峰形进一步改善(Fig.4C)。USP流动相中的磷酸二氢钾溶液(pH4.3)非缓冲液,实为几无缓冲容量的盐溶液,易导致缓冲液过载,如进样量较大则难以控制青霉素G在流动相中的解离即二次化学平衡,且流动相的离子强度较低,故色谱峰形随着进样量的增加而显著展宽(Fig.4A)。将流动相中磷酸二氢钾的浓度增至50mmol/L,增加了流动相的缓冲容量和离子强度,色谱峰形相应改善(Fig.4B);进一步调节磷酸二氢钾溶液的pH值至3.5,则流动相的缓冲容量显著增加,且由于在含有乙腈的流动相中,化合物