基因工程 课件 酶工程

食品酶工程1主要内容食品酶工程概述酶的生产与改造酶的固定化及其生产应用技术酶工程在食品工业中的应用2前言早在几千年我们的祖先就曾有酿酒、制醋、做酱的记载,所有这些,实际上都是酶知识的应用。现在，酶工程已在医药、食品、工业、农业、饲料、环保、能源、科研等领域广泛应用。种类繁多的药品，如抗生素、维生素等1

基因工程药品：如人生长素、乙肝疫苗、单抗等2

微生物发酵药品：如人胰岛素、干扰素等3一、酶工程技术在医药工业中的应用酶学研究简史1878德国的Kuhne

定义Enzyme原意为在酵母中1926美国的Sumner从刀豆中得到脲酶结晶（1947年诺贝尔奖）1970美国的Smith发现限制性内切酶（1979年诺贝尔奖）1969日本固定化氨基酰化酶，第一次将固定化酶成功地应用于工业生产。——酶工程诞生1986美国核酶发现获得诺贝尔奖6

概念：酶工程（EnzymeEngineering）又称酶技术，是指酶的大批量生产以及利用酶、细胞器或细胞所具有的特异催化功能，或对酶结构进行修饰改造，通过适当的反应器，并借助于工程技术手段，有效地发挥酶的催化特性来生产人们所需产品或达到某种特殊目的的技术。7研究内容（一）酶的产生

酶制剂的来源有微生物、动物和植物，也有人工合成酶。但是主要的来源是微生物。由于微生物比动植物具有更多的优点，因此，一般选用优良的产酶菌株，通过发酵来产生酶。为了提高发酵液中的酶浓度，选育优良菌株、研制基因工程菌、优化发酵条件。工业生产需要特殊性能的新型酶，如耐高温的α—淀粉酶、耐碱性的蛋白酶和脂肪酶等，因此，需要研究、开发生产特殊性能新型酶的菌株。8研究内容（二）酶的提取分离

酶的分离提纯技术是当前生物技术“后处理工艺”的核心。采用各种分离提纯技术，从微生物细胞及其发酵液，或动、植物细胞及其培养液中分离提纯酶，制成高活性的不同纯度的酶制剂，为了使酶制剂更广泛地应用于国民经济各个方面，必须提高酶制剂的活性、纯度和收率，需要研究新的分离提纯技术。10研究内容（三）酶和细胞固定化

酶和细胞固定化研究是酶工程的中心任务。为了提高酶的稳定性，重复使用酶制剂，扩大酶制剂的应用范围，采用各种固定化方法对酶进行固定化，制备了固定化酶，如固定化葡萄糖异构酶、固定化氨基酰化酶等，测定固定化酶的各种性质，并对固定化酶作各方面的应用与开发研究。11研究内容（三）酶和细胞固定化

固定化细胞是在固定化酶的基础发展起来的。用各种固定化方法对微生物细胞、动物细胞和植物细胞进行固定化，制成各种固定化生物细胞.研究固定化细胞的酶学性质，特别是动力学性质，研究与开发固定化细胞在各方面的应用，是当今酶工程的一个热门课题。12研究内容（四）酶分子修饰

又称为酶分子修饰。为了提高酶的稳定性，降低抗原性，延长药用菌在机体内的半衰期，采用各种修饰方法对酶分子结构进行改造，以便创造出天然酶所不具备的某些优良特性(如较高的稳定性、无抗原性、抗蛋白酶水解等)，甚至于创造出新的酶活性，扩大酶的应用，从而提高酶的应用价值，达到较大的经济效益和社会效益。13研究内容（五）有机介质中的酶反应

由于酶在有机介质中的催化反应具有许多优点。因此，近年来，酶在有机介质中催化反应的研究，已受到不少人的重视，成为酶工程中一个新的发展方向。酶在有机介质中要呈现很高的活性，必须具备哪些条件？有机介质对酶的性质有哪些影响？如何影响？近年来，对这些问题的研究，已取得重要进展。14研究内容（六）酶传感器

又称为酶电极。酶电极是由感受器(如固定化酶)和换能器(如离子选择性电极)所组成的一种分析装置，用于测定混合物溶液中某种物质的浓度，其研究内容包括：酶电极的种类、结构与原理；酶电极的制备、性质及应用。15研究内容（七）酶反应器

酶反应器是完成酶促反应的装置。其研究内容包括：酶反应器的类型及特性；酶反应器的设计、制造及选择等。16研究内容（七）酶反应器抗体酶是一类具有催化活性的抗体。是抗体的高度专一性与酶的高效催化能力二者巧妙结合的产物。其研究内容是：抗体酶的制备、结构、特性、作用机理、催化反应类型、应用等。人工酶是用人工合成的具有催化活性的多肽或蛋白质。据1977年Dhar等人报道，人工合成的Glu—Phe—Ala—Glu—Glu—Ala—Ser—Phe八肽具有溶菌酶的活性。其活性为天然溶菌酶的50%。17研究内容（八）酶反应器利用有机化学合成的方法合成了一

些比酶结构简单得多的具有催化功能的非蛋白质分子。这些物质分子可以模拟酶对底物的结合和催化过程。既可以达到酶催化的高效率，又能够克服酶的不稳定性。这样的物质称为模拟酶。用环糊精已成功地模拟了胰凝乳蛋白酶等多种酶。18研究内容（九）酶技术的应用在医学、食品、发酵、纺织、制革、化学分析、氨基酸合成、有机酸合成、半合成抗生素合成、能源开发以及环境工程等方面的应用都很广泛。①运用酶技术生产有重要价值的产品。②利用酶制剂改进生产工艺，提高产品质量和产率，降低生产成本。1920酶生产酶的生物合成酶的分离酶的纯化第二节酶生产与修饰21酶生产与修饰提取分离法

22生物合成法

生物合成法

24

1949年，日本千畑一郎成功的用细菌液体深层发酵法生产出了α-淀粉酶，从此酶制剂的生产逐步转向以微生物发酵生产酶。化学合成法

25化学合成法

26微生物发酵法产酶的优点：（1）微生物种类多，酶种丰富，且菌株易诱变，菌种多样（2）微生物生长繁殖快，酶易提取，特别是胞外酶（3）来源广泛，价格便宜（4）微生物易得，生长周期短27微生物发酵法产酶的优点：（5）可以利用微电脑技术控制酶的发酵生产，可进行连续化，自动化，经济效益高（6）可以利用以基因工程为主的分子生物学技术，选育和改造菌种，增加产酶率和开发新酶种。28微生物发酵法产酶的优点：4、微生物具有较强的适应性和应变能力，可以通过适应、诱变、基因工程、细胞融合等方法培育出高产量的菌种。从微生物中获得的酶有：α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、异淀粉酶。29安全可靠，非致病菌，不产生毒素或其他生理活性物质，这样才能确保酶生产和应用的安全。能利用廉价原料且良好生长产酶性能稳定，菌株不易退化，不易受噬菌体侵袭繁殖快，产酶量高，有利于缩短生产周期。产生的酶容易分离纯化产酶微生物：细菌、放线菌、霉菌、酵母菌301、产酶微生物培养基原料（1）碳源（2）氮源（3）碳氮比（4）无机盐（5）生长因子（6）产酶促进剂：诱导物+表面活性剂312、酶的发酵技术控制培养方法（1）固体培养法麸曲培养法：浅盘法、转筒法、厚层通气法（2）液体培养法液体表面培养、液体深层培养323、酶的发酵技术控制微生物发酵条件的控制（1）温度

332、酶的发酵技术控制微生物发酵条件的控制（2）pH

343、酶的发酵技术控制微生物发酵条件的控制（3）通风量

353、酶的发酵技术控制微生物发酵条件的控制（4）搅拌（5）泡沫（6）湿度

363、酶的发酵技术控制一般过程：破碎细胞（或不破碎细胞）→溶剂抽提→离心→过滤→浓缩→干燥或结晶

374、微生物酶制剂的提取和精制二、酶修饰

酶的分子修饰原因（不足）1．稳定性不够，不能适应大量生产的需要。2．作用的最适条件不符（pH）。3．酶的主要动力学性质的不适应。4．临床应用的特殊要求（具有抗原性）。38二、酶修饰

（一）酶化学修饰的方法

广义：涉及共价键或部分共价键的形成或破坏的转变，从而改变酶的酶学性质。

狭义：在温和的条件下，以可以控制的方式使酶同某些化学试剂特异反应，从而引起单个氨基酸残基或其功能发生共价的化学变化酶工程要求：酶活力保持不变或损失不多，同时具备新的特性和功能。39二、酶修饰

（一）酶化学修饰的方法

修饰剂：通过集团的特性，使被修饰分子化学集团引入或除去而使酶蛋白共价结构发生改变（侧链集团的取代、肽链的限制性水解、分子内或分子间的交联）或者使化学分子侧链基团发生结构性的改变的物质。40

1、酶分子的主链修饰主链：肽链和核苷酸链利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。酶蛋白主链修饰主要是靠酶切/酶原激活法。（切除一部分，不影响催化活性，但抗原性改变）41（一）酶分子的化学修饰

2、酶分子的侧链修饰组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团修饰方法：氨基修饰、羧基修饰、巯基修饰、胍基修饰、酚基修饰、咪唑基修饰、吲哚基修饰。α-胰凝乳蛋白酶表面的氨基修饰成亲水性更强的-NHCH2COOH,酶活力在60℃提高1000倍。42（一）酶分子的化学修饰

3、大分子结合修饰（有机大分子）最重要的修饰方法之一。显著提高酶活、增强稳定性、降低抗原性。蛋白分子构象发生改变。水溶性大分子修饰剂：右旋糖酐、聚乙二醇、肝素、聚蔗糖β-环糊精、壳聚糖、白蛋白、明胶、淀粉、聚氨基酸。43（一）酶分子的化学修饰4、金属离子置换修饰酶分子中含有金属离子，往往是活性中心的组成部分。如：α-淀粉酶的Ca2+。将金属离子置换，可提高酶活力、增强稳定性，但也有是酶活性降低，甚至失活。44（一）酶分子的化学修饰5、酶分子的组成单位置换修饰酶分子的基本单位包括：氨基酸和核苷酸。酶分子的组成单位置换修饰方法主要通过遗传工程的手段来进行的。（定点突变技术）45（一）酶分子的化学修饰

物理方法：高温、高压、高盐、真空使空间构象发生改变，从而改变酶的特性和功能。酶的共价键不改变。只是副键变化和重排。46（二）酶分子的物理修饰（1）热稳定性（提高）固定酶的分子构象；（2）抗原性（PEG，部分消除）人血清蛋白；（3）体内半衰期（延长）；（4）最适pH；（5）酶学性质的改变（米氏常数Km）；47（三）修饰酶的性质及特点

（6）对组织的分布能力变化（血液里靶器官选择性吸收）；（7）对各类失活因子（蛋白酶、抑制剂）的抵抗力提高。48（三）修饰酶的性质及特点第三节酶和细胞的固定化技术固定化酶固定化酶与自由酶的概念

自由酶

(FreeEnzyme)

酶直接加入至溶液中，酶自身的空间结构不发生改变，保持自己的生物特性固定化酶

(ImmobilizedEnzyme)

通过物理或化学的手段，将酶固载在某种基体上。50固定化酶的优点（1）固定化酶可以多次使用，而且在多数情况下，酶的稳定性提高。（2）固定化酶极易与底物、产物分开，因而产物溶液中，没有酶的残留，简化了提纯工艺，产率较高，产品质量较好。（3）固定化酶的反应条件易于控制，可以装柱（塔）连续反应，宜于自动化生产，节约劳动力，减少反应器占地面积。固定化酶的优点（4）较水溶性酶更适合于多酶反应。（5）辅酶固定化和辅酶再生技术，将使固定化酶和能量再生体系或氧化还原体系合并使用，从而扩大其应用范围。（6）增加产物的收得率，提高产物质量。固定化酶的缺点

（1）固定化酶所用载体与试剂较贵、成本高、工厂投资大，加上固定化过程中酶活力有损失，即酶活力回收率低，更增加了工业化生产的投资困难。如果用胞内酶进行固定化，还要增加酶的分离成本。固定化酶在长期使用后，因染杂菌，酶的渗漏，载体降解以及其它错误操作，也会致使酶失活。53固定化酶的缺点

（2）固定化酶一般只适用于水溶性的小分子底物；大分子底物常受载体阻拦，不易接触酶，致使催化活力难以发挥。（3）目前固定化酶尚限于单级反应，多酶反应，特别是需要辅因子的固定化酶技术，还有待开发。54制备原则1、必须注意维持酶的构象，特别是活性中心构象（关键氨基酸残基不被固定；高级结构，条件温和）2、酶与载体必须有一定的结合程度（构象不影响）3、固定化应有利于自动化、机械化操作4、固定化酶应有最小的空间位阻5、固定化酶应有最大的稳定性6、固定化酶的成本适中固定化酶的方法

56吸附法包埋法共价结合法交联法物理吸附法离子吸附法酶直接交联法酶辅助蛋白交联吸附交联法交联包埋法交联酶聚集体定向/共固定58固定化酶的性质1、固定化酶活性比天然酶的活力低的原因：①酶活性中心的重要氨基酸残基与水不溶性载体相结合②酶与载体结合时，酶的高级结构发生改变，其构象的改变导致酶与底物结合能力或催化底物转化能力的改变③酶被固定化后，虽不失活，但酶与底物间相互作用受到空间位阻的影响；固定化酶的性质1、固定化酶活性也有酶经固定化活性升高的，可能是因为固定化后酶的抵抗能力提高使得它反而比游离酶活力高；固定化酶的性质2、固定化酶稳定性稳定性增高的表现：（1）操作稳定性，固定化酶在操作中可以长时间保留活力，一般情况下，半衰期在一个月以上，即有工业应用价值。（2）贮藏稳定性，固定化可延长酶的贮藏有效期。（3）热稳定性，大多数酶在固定化之后，其热稳定性都有所提高。固定化酶的性质2、固定化酶稳定性稳定性增高的表现：（4）对蛋白酶的稳定性，酶经固定化后，其对蛋白酶的抵抗力提高。（5）酸碱稳定性，多数固定化酶的酸碱稳定性高于游离酶，稳定pH范围变宽。3、固定化酶反应特性1）底物特异性。底物为小分子化合物时，固定化酶的底物特异性大多数情况下不发生改变。底物为大分子化合物时，一般随着底物分子量的增加，固定化酶的活力下降。3、固定化酶反应特性2）反应的最适pH。酶被固定后，载体如带负电荷，最适pH比游离酶的最适pH高（向碱性方向移动）；载体如带正电荷，最适pH比游离酶的最适pH低（向酸性方向移动）。3、固定化酶反应特性3）反应的最适温度。固定化酶的最适反应温度多数比游离酶高；最适温度会受固定化方法和固定化载体的影响。3、固定化酶反应特性4）米氏常数。Km是反映酶与底物的亲和力。蛋白质的高级结构和载体电荷可导致酶与底物的亲和力发生变化3、固定化酶反应特性5）最大反应速度。固定化酶的最大反应速度与游离酶大多数是相同的。三、影响固定化酶性质的因素1、酶本身的变化活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生变化。2、载体的影响分配效应、空间障碍效应和扩散限制效应。3、固定化方法的影响四、固定化活细胞酶反应器与酶传感器酶反应器的概念

指以酶作为催化剂进行反应所需的设备，是游离酶、固定化酶或固定化细胞催化反应的容器。反应器的作用

以尽可能低的成本，按一定的速度由规定的反应物制备特定产物。72常见酶反应器的特点与类型

按几何形状和结构来分，可分为罐型、管型、膜或片型几种。按进料和出料的方式可分为分批式、半分批式与连续式反应器。按其功能结构可分为膜反应器、液固反应器及气液固三相反应器三大类。737475间歇式搅拌罐

又称分批式搅拌罐，由容器、搅拌器的恒温装置组成。酶的底物一次性加入反应器，而产物一次性取出。该反应器结构简单，造价较低，适于小规模试验。但是反应效率低，搅拌桨的剪切易使固定化酶颗粒受到磨损、破碎，容易造成酶失活，游离酶不能回收，操作麻烦，不适于大规模工业生产。76连续式搅拌罐又称为连续搅拌釜式反应器。77

指的是向反应器投入固化酶和底物溶液，不断搅拌，反应达到平衡之后，再以恒定的流速补充新鲜底物溶液，以相同流速输出反应液。不需要将固定化酶滤出，操作简便。但是反应效率低，搅拌动力消耗大。为了提高反应效率，可以把几个搅拌罐串联起来组成串联酶反应器。78固定床反应器又称填充床反应器79将固定化酶填充于反应器内，制成稳定的固定床。底物溶注以一定的方向和流速不断地流进固定床，产物从固定床出口不断流出来。优点：可使用高浓度的生物催化剂，反应效率高；由于产物不断流出，可减少产物对酶的抑制；结构简单，容易操作。缺点：传质系数和传热系数较低；床内压力大，底物溶液必须加压才能流入柱内；床内有自压缩倾向；更换固定化酶较麻烦。80流化床反应器与连续流搅拌桶式反应器类似，是让适量的颗粒状酶悬浮于反应床中，不用搅拌器，而是底物向上流过固定酶床，因此流速要适当控制。81膜型反应器由膜状或板状的固定化酶所组装的反应器。螺旋卷膜式反应器：将含酶的膜片与支持材料交替地缠绕在中心棒上。中空纤维膜式反应器：内层是紧密光滑的半透性膜，有一定的分子量截留值，其外层是多孔海绵状的支持层。超滤膜酶反应器：又称为搅拌罐-超滤组合反应器。在连续搅拌罐的出口处，设置一个超滤器。82第二代酶反应器酶反应器有下列技术问题需要解决：需要辅因子参与的反应，如何使辅因子再生受产物抑制的酶反应，如何将产物移去，以消除产物抑制作用。底物不溶或微溶于水的酶反应，如何使酶反应在两相或多相中进行。多酶反应如何使几种酶在反应器中催化有序反应。83吸附法吸附法分为物理吸附法和离子交换吸附法。物理吸附法:通过氢键、疏水作用和π电子亲和力等物理作用，将酶固定于水不溶载体上．从而制成固定化酶。常用的载体有：

①有机载体。纤维素、骨胶原、火棉胶及面筋、淀粉如：木瓜蛋白酶、碱性磷酸脂酶吸附后在载体表面形成单分子层，吸附蛋白能力约70mg/cm2。84②无机载休。氧化铅、皂土、白土、高岭土、多孔玻璃、二氧化钛等。如：用多孔硅为载体吸附米曲霉和枯草杆菌的淀粉酶以及黑曲霉的糖化酶，在45℃进行固定化，用高浓度的底物进行连续反应．半衰期分别为14、35、60d。无机载体的吸附容量较低、而且酶容易脱落。

85(2)离子交换吸附法:

将酶与含有离子交换基的水不溶载体相结合而达到固定化的一种方法。酶吸附较牢，在工业上颇具广泛的用途。常用的载体有阴离子交换剂，如二乙基氨基乙基(DEAE)-纤维素、DEAE—葡聚糖凝胶；阳离子交换剂，如羧甲基(CM)—纤维素、纤维素柠檬酸盐等。

86优点：

吸附法制备固定化酶操作简单，可充分选择不同电荷、不同形状的载体，吸附过程可以同时纯化酶固定化酶在使用过程失活后可重新活化，同时，载体可以回收再利用。缺点：

吸附法制备的固定化酶易脱落，影响产物纯度和酶的操作为稳定性。

87包埋法

包埋法是将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合助进剂(包括交联剂)的作用进行聚合，酶被包埋在聚合物中以达到固定化。包埋法常用凝胶包埋法和微囊化法。优点:

包埋法操作简单，由于酶分子只被包埋，未受到化学反应，可以制得较高活力的固定化酶．对大多数酶、粗酶制剂甚至完整的微生物细胞都是适用的

88缺点:

只有小分子底物和产物可以通过凝胶网络，而对大分子底物不适宜。同时，凝胶网络对物质扩散的阻力导致固定化酶动力学行为的变化、活力降低。

89凝胶包埋法:

凝胶包埋法是将酶分子包埋在凝胶格子中。①聚丙烯酰胺凝胶包埋法

聚丙烯酰胺包埋法的缺点是酶容易漏失，以低分子量蛋白质为甚，如果调整交联剂浓度与交联程度可以得到克服。90②辐射包埋法。

酶溶于纯单体水溶液、单体加合物水溶液或纯聚合物溶液中．在常温或低温下，用x—射线、Y—射线或电子束辐照。可得到包埋酶的亲水凝胶。如用X—射线引发聚丙烯酰胺聚合，可以固定胰蛋白酶。可以使用玻璃化单体，玻璃化单体和非玻璃化单体混合物、单体和天然聚合物的混合物为载体。

91③其他凝胶包埋法。

a.淀粉凝胶包埋法。b.胶原包埋法即大分子络合法。

其制备方法极为简单：将酶加到胶原悬浮液中、铺膜、干燥即得固定化酶。或者经过透析的酶和胶原混合，插入电极，酶—胶原复合物便在电极上沉淀。

92(2)微囊化法:将酶包埋于具有半透性聚合物膜的微囊内。它使酶存在于类似细胞内的环境中，可以防止酶的脱落，防止微囊外环境直接接触．从而增加了酶的稳定性．同时，小分子底物能通过膜与酶作用，产物经扩散而输出。微囊一般直径约1～100um，膜厚约100nm，膜上孔径约3.6nm，表面积与体积之比极大，能有效的包埋许多种酶。微胶囊的制备方法有4种。

93①界面聚合法。

将疏水和亲水单体用一种与水不混溶的有机溶剂作成乳化剂.再将溶于同一个有机溶剂的疏水单体溶液,在搅拌下,加入上述乳化液中,在乳化液中的水相和有机溶剂相互之间的界面发生聚合化,水相中的酶即被包埋于聚合膜内.此法曾用来制备脲酶等。

94②液体干燥法。此法曾用乙基纤维素和聚苯乙烯包埋过氧化氢酶、脂肪酶等。它是将一种聚合物溶于一种沸点比水低，且与水不混溶的溶剂中．加入酶液后，加入油溶性表面活性剂为乳化剂使之乳化。再把它分散于含有保护性胶质如明胶、聚丙烯醇和表面活性剂的水溶液中，第二次乳化.在不断搅拌下，低温真空除去有机溶剂，便得含酶微囊。常用聚合体有乙基纤维素、聚苯乙烯、氯橡皮等，有机溶剂有苯、环己烷和氯仿。95③脂质休包埋法。

采用双层脂质体形成极细球粒包埋酶。例如．将卵磷脂、胆甾醇和二鲸腊磷酯按7：2：1溶于氯仿中．再加入酶液，混合物在旋转蒸发器中，在氮气下32℃转动乳化，然后在室温下保持2h，再在氮气气流中．4℃用音波处理10s，在室温下保持2h，过Sepharose6B柱，收集脂质体，离心分离脂质体，所得球粒悬浮于缓冲液中，继续音波处理，并过Sepharose6B柱，可得含酶的微囊。96共价键结合法

共价键结合法是酶蛋白的侧链基团和载休表面上的功能基团之间形成共价键而固定的方法。其优点是：酶与载体结合牢固，酶不易脱落，但反应条件较激烈，酶易失活，同时，制作手续亦较繁琐。（1）酶分子和载体连接的功能基团氨基、羧基、酚基、巯基……972)载体的选择

载体直接关系到固定化酶的性质和形成。对载体的一般要求是:①一般亲水载体在蛋白质结合量和固定化酶活力及其稳定性上都优于疏水载体。

②载体结构疏松，表面积大，有一定的机械强度。

③载体必须有在温和条件与酶共价结合的功能基团。

④载休没有或很少有非专一性吸附。

⑤载体来源容易，方便，并能反复使用。98(3)偶联反应

酶和载体的连接反应取决于载体上的功能基团和酶分子上的非必需侧链基团，而且是在十分温和的pH、中等离子强度和较低温的缓冲液中进行。

重氮法：是将带芳香族氨基的载体，先用NaNO2和稀盐酸酸处理成重氮盐衍生物，再在中性偏碱(pH8—9)条件下与酶蛋白发生偶联反应，得到固定化酶。99

交联法交联酶法:

在一定条件下，加入一定量的戊二醛溶液于酶溶液中，生成不溶性固定化酶。

如:木瓜蛋白酶和戊二醛在pH6.0、0℃长时间反应，只得可溶性固定化酶，若在室温下0一5h，即可形成不溶性固定化酶。这种情况对不同酶可能有不同结果。

100酶与辅助蛋白交联法:

用双功能或多功能试剂使惰性蛋白与酶共交联．从而制备固定化酶.辅助蛋白，如牛血清白蛋白、明胶、胶原、抗体等，与酶一起进行交联。例如：10mg脲酶与2.5ml含6％白蛋自、0.2％戊二醛的0.02mol/LpH．8磷酸缓冲液混合，冷到—30后，冉升温至4下,放置4h将形成的泡沫聚合物彻底洗除后，冻干，即为固定化脲酶。

101载体交联法

是用多或双功能试剂的一部分功能基团与载体交联，另一部分功能基团与酶蛋白交联而制备固定化酶的方法。单用戊二醛等试剂交联制备的固定化酶活力较低，常将此法与吸附法、包埋法结合使用，可以达到既提高固定化酶的活力，又起到加固的效果。

102103固定化酶的性质固定化酶活力：与其溶液酶相比，大多数固定化酶活性下降。固定化酶活力下降的原因主要有：酶与不溶性载体相结合引起结构发生了变化；酶活性中心的重要氨基酸残基与裁体相结合。104酶固定化效果的测定

固定化酶活力：每毫克干重固定化酶每分钟转化1umol底物量或形成1umol产物的酶量为一个单位(umol/mg·min)，对于酶管、酶膜、酶板等，则以单位面积（cm2）的初速度来表示。偶联效率偶联效率以载体结合酶量(或酶活力)的百分数表示：

105活力回收和相对活力酶固定化—般比溶液酶的活力下降，固定化酶活力占溶液酶活力的百分数称为活力回收。

106固定化酶的稳定性

大多数酶在固定化后都不同程度地提高了稳定性．延长了有效寿命。这是由于：第一，固定化增加了酶构象的牢固程度。第二，挡住了不利因素对酶的侵袭。第三，限制了酶分子间的相互作用。107热稳定性

大多数酶在固定化后与溶液酶相比，有较高的热稳定性如氨基酰化酶。溶液酶在75℃保温15min，活力为0；DEAE—Sephadex固定化酶在同样条件下仍有80％；DEAE—纤维素固定化酶在同样条件下还有60％活力。这种性质对工业上的应用是有益的。固定化酶反应的温度一般较溶液酶的高如用CM—纤维素固定的胰蛋白酶和糜蛋白酶的最适温度比溶液酶高5—15℃。

108pH一酶活力关系反应的最适pH和酶活力—pH曲线的变动依据酶蛋白和载体的电荷而定。带负电荷的载体，往往导致固定化酶的最适pH向碱性方向移动；带正电荷的载体则相反。例如：DEAE—纤维素固定化氨基酰化酶与其游离酶比较，低0.5个pH而偏向酸性方向。CM一纤维素固定化的胰蛋白酶、糜蛋白酶的最适pH与游离酶比较，向碱性方向偏移0.5—1个pH单位。

109对蛋白酶的抵抗力提高

溶液酶经固定化后提高了对蛋白酶的抵抗能力。比如：氨基酰化酶在胰蛋白酶作用下活力仅存20％，而将其固定于DEAE—纤维素上在同样条件下仍有80％的活力。这可能是因为蛋白酶分子量大，受到空间位阻，不能进入固定化酶中.

110对变性剂、抑制剂的抵抗能力提高

酶经固定化后，提高了对蛋白质变