免疫组化(00002)课件

免疫组织化学技术及其分析、免疫组化技术

免疫组化技术应用实验步骤器材与试剂标本概论本卷须知1.1.1

原理

目的1.1.3

常用方法

1.1

概论应用免疫学根本原理—抗原抗体特异性结合的原理，通过化学反响使标记抗体的显色剂显色(标记物有酶,荧光素等).来确定组织细胞内抗原，对其进行定位，定性，定量的研究.

原理

目的

检测组织细胞中相关抗原的分布及含量等即组织细胞中的待测抗原，参加由酶、荧光素等标记的抗体，形成抗原抗体复合物，参加显色剂，在酶的催化下，显色剂发生化学反响，形成有色的沉淀物，沉积在细胞上，根据其染色位置、深浅，检测出待测抗原的分布区域以及含量等。

免疫组化常用方法组织抗原第一抗体第二抗体过氧化物酶直接法间接法

直接免疫荧光法间接免疫荧光法

免疫组化常用方法

器材：微波炉、高压锅、微量加样器、修复盒、湿盒、染色架、免疫组化笔、防脱载玻片、盖玻片、脱水机、切片机、石蜡包埋机、摊片机、烤片机、冰箱、电磁炉、计时器、微型漩涡震荡仪。1.2

器材与试剂1.2

器材

1.PBS：0.01M磷酸盐缓冲液〔PH=7.4)2.抗原修复液：0.01M柠檬酸盐〔枸橼酸盐〕缓冲液〔PH=6.0)3.固定液：10%中性缓冲福尔马林：〔甲醛1份+0.01MPH7.4的PBS9份配制而成)，4%多聚甲醛等。4.防脱剂：0.5%多聚赖氨酸。5.包埋剂：石蜡。6.一抗、免疫组化检测试剂盒。7.TO生物透明剂、梯度酒精、3%H2O2、中性树胶。8.显色剂：苏木素染液、DAB试剂等1.2

试剂1.3

标本组织标本细胞标本组织印片石蜡切片冰冻切片病理切片组织芯片细胞爬片细胞涂片石蜡切片是制作组织标本最常用、最根本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回忆性研究。染色1.4.41.4

实验步骤免疫组织化学技术及其分析

抗原修复

1.4.3

脱蜡和水化1.4.2

石蜡切片制作1.4.1石蜡切片80%酒精〔3min)1.4.1脱蜡和水化无水乙醇〔3min)TO透明剂(10min)

95%酒精(3min)75%酒精(3min)PBS洗5min×3次)

免疫组织化学技术及其分析TO透明剂(10min)1.4.2抗原修复高压锅热修复法微波加热方法原理：通过热能，在某些化学物质的作用下，翻开蛋白的交联键，暴露抗体所识别的抗原决定蔟。方法：切片脱蜡至水后，放入盛有缓冲液的修复盒中，置微波炉中火煮10分钟。冷却或放在流水中冷却.注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以免使蛋白恢复原有的空间构型。组织切片放入盛有抗原修复液的高压锅内,加筏后高压2分30秒.此方法可快速翻开抗原决定簇,有利于抗原抗体的特异性结合,是目前常用的抗原修复方法。.１.4.3常用免疫组化染色方法SP法EnVision法EPOS法SABC法CSAII法19免疫组织化学技术及其分析

SP法SP法

1.特点：为生物素检测系统，需封闭内源性生物素，三步法染色。2.试剂盒：包含生物素标记的抗鼠/抗兔/抗羊免疫球蛋白工作液，标记HRP或AP的链菌抗生物素蛋白工作液3.染色步骤：〔1〕组织切片经脱蜡水化后，按以下步骤进行：〔2〕PBS洗，3分钟×3次；〔3〕3%H2O2孵育10分钟，以灭活内源性过氧化物酶的活性。〔4〕必要时进行抗原修复〔5〕PBS洗，3分钟×3次；〔6〕正常血清封闭后滴加一抗，孵育30~40分钟或4℃冰箱夜；〔7〕PBS洗，10分钟×3次；〔8〕滴加鼠/兔/羊二抗，孵育20~30分钟，〔9〕PBS洗，10分钟×3次；〔10〕滴加链菌抗生物素蛋白/HRP三抗，常温孵育30~40分钟；〔11〕PBS洗，5分钟×3次；〔12〕DAB显色,可在显微镜下观察染色程度；〔13〕常水洗净；〔14〕擦干后苏木素染色数分钟；〔15〕流水冲洗；〔16〕盐酸酒精分化，流水冲洗10分钟；〔17〕脱水、透明、封片。1.4.5.1SP法

22免疫组织化学技术及其分析1.4.5.2EnVision法

EnVision法1.特点：为非生物素检测系统，可防止内源性生物素干扰，不需要进行封闭内源性生物素操作，加一抗前也不需要正常血清封闭，具有敏感性高，操作简便，非特异性染色少的优点。2.试剂盒:只有EnVision/HRP/鼠/兔二抗或EnVision/AP/鼠/兔二抗3.染色步骤：〔1〕组织切片经脱蜡水化后，按以下步骤进行：〔2〕PBS洗，3分钟×3次；〔3〕3%H2O2孵育10分钟，以灭活内源性过氧化物酶的活性。(4)必要时进行抗原修复(5)PBS洗，3分钟×3次；(6)滴加一抗，孵育30~40分钟或4℃冰箱夜；(7)PBS洗，10分钟×3次；(8)滴加EnVision/HRP/鼠/兔二抗，常温孵育30~40分钟；(9)PBS洗，5分钟×3次；(１０)DAB显色,可在显微镜下观察染色程度；(１１)常水洗净；(１２)擦干后苏木素染色数分钟；(１３)流水冲洗；(１４)盐酸酒精分化，流水冲洗10分钟；(１５)脱水、透明、封片。EnVision法石蜡人乳腺导管癌ER染色，胞核阳性，SP法，DAB染色1.6应用石蜡，人甲状腺癌CD44V6染色，胞膜阳性，SP法，DAB染色抗GBM肾小球肾炎，IgG呈细线状毛细血管壁沉积，＋＋＋＋〔荧光×400〕局灶节段性肾小球硬化症，IgM呈沉积于病变部位，＋＋＋＋〔荧光×400〕

免疫组织化学技术及其分析1.5本卷须知

抗体的保存免疫组化结果的判断原那么引起假阴性与假阳性的主要原因

染色中的常见问题及对策本卷须知29

浓缩抗体：有效期内只需放在4℃冰箱内保存，时间达1-3年。

即用型抗体：理论上在4℃冰箱内可保存半年左右。

PBS或抗体稀释液稀释的抗体：一般只可放置1-2个月。1.5.1抗体的保存1.5.2染色中的常见问题及对策免疫组织化学技术及其分析1234567脱片;无特异性表达;表达较弱;染色过强;染色定位不好;非特异性背景染色;封片时的本卷须知;1.5.3.1脱片的可能原因与对策整批切片脱片单张切片及整块组织脱片可能是载玻片未处理，玻片上有油污未清洗或未涂抹防脱片胶，或烤片时间缺乏致粘片不牢固。除了上述原因外，需考虑抗体热修复时液体温度过高和时间过长，或冲洗时用力过猛等因素。免疫组织化学技术及其分析※标本固定方式不当或固定时温度过高，使局部组织抗原被破坏；※抗原修复方式不当；※抗体浓度过低，或者孵育的温度、时间不够；※冲洗后切片残留多余缓冲液。如果阴性对照没有反响，阳性对照反响良好，而标本弱阳性，应考虑查标本本身原因。※新鲜组织及时固定，防止自溶，固定时间不超过24小时；※封闭时间不超过10分钟，或参考产品说明；※注意复染时间；※提高抗体浓度，孵育时间不少于60分钟〔室温低于15℃，改在37℃温箱孵育或4℃冰箱过夜〕问题解决方法1.5.3.2表达较弱免疫组织化学技术及其分析※抗体浓度过高或孵育时间过长。※孵育温度过高，＞37℃

※显色速度过快或显色时间过长；※降低抗体浓度、孵育时间；※室温1小时或4℃过夜；※缩短显色时间；显色时间不超过5～10分钟，以显微镜下观察为准；问题解决方法1.5.4.4染色过强免疫组织化学技术及其分析※操作过程中冲洗不充分；※加试剂后切片枯燥；※组织切片折叠；※组织中含过氧化物酶未阻断；※组织中含内源性生物素；※组织抗原弥散；※切片粘附剂过厚；※血清蛋白封闭不充分；※每步冲洗3×5′；※防止切片枯燥〔必要时重做〕；※勿以折叠处观察染色结果；※可