一株去卵巢骨质疏松大鼠骨组织形态参数的变化

一株去卵巢骨质疏松大鼠骨组织形态参数的变化

随着老龄化社会的到来，绝经后骨质疏松症的预防和治疗已成为人们关注的问题之一。中医药在此领域有着明显的优势,开发治疗骨质疏松的中成药具有重要意义。我们在以往的工作中发现乌鸡白凤丸对实验性骨质疏松大鼠有一定的防治作用,为进一步探讨其对骨微观结构的影响,本研究采用卵巢切除致大鼠骨质疏松模型,通过骨形态计量学参数的变化,以评价其抗骨质疏松作用。1材料和方法1.1材料表面1.1.1g/粒—药物与试剂乌鸡白凤丸(54g/瓶),药都制药集团股份有限公司,批号060501;仙灵骨葆胶囊(0.5g/粒),贵州同济堂制药有限公司,批号060412;盐酸四环素,江苏长青兽药有限公司,批号20060712;甲基丙烯酸甲酯,北京益利精细化学品有限公司,批号960523;邻苯二甲酸二丁酯,北京化学试剂公司,批号970628;过氧化苯甲酰,北京金龙化学试剂有限公司,批号20000420。1.1.2leicaqun管理Reicheit-Jung2040切片机(德国);LeicaQwin图象分析系统(德国);Olympus显微镜(日本);Opton荧光显微镜(德国)。1.1.3动物饲料中心6月龄SD大鼠(清洁级),♀性,由河北省实验动物中心提供,许可证号为:SCXK(冀)2003-1-3,动物饲料亦由该中心提供;各组大鼠分笼饲养,自由摄食、饮水,光照12h,黑暗12h,室温20～24℃,相对湿度40%～70%。1.2动物分组、药物行为和统计学处理1.2.1动物模型将大鼠以10%水合氯醛按350mg/kg腹腔注射麻醉,腹位固定,无菌条件下摘除双侧卵巢,逐层缝合肌肉和皮肤切口,假手术组只做同样操作但不切除卵巢。1.2.2分组与给药术后1周,将存活的大鼠按体重随机分为假手术组、去卵巢模型组、乌鸡白凤丸低剂量组(1.0g/(kg·d))、乌鸡白凤丸中剂量组(2.0g/(kg·d))、乌鸡白凤丸高剂量组(4.0g生药/(kg·d))及阳性药仙灵骨葆组(0.6g/(kg·d)),每组10只。各组大鼠每天上午灌胃给药,给药容量为10mL/kg,假手术组及去卵巢模型组大鼠给予等容量蒸馏水,连续灌胃12周。1.2.3标本处理各组动物于处死前16d和前3d分别腹腔注射盐酸四环素30mg/kg体重以对骨进行荧光标记。末次给药后,将各组大鼠迅速断头处死,剥离出胫骨,用70%乙醇固定。取大鼠左侧胫骨近端1/3,去除软组织。用乙醇逐级脱水,二甲苯透明,每级各两次,每次24h。浸透液的配制:Ⅰ液:甲基丙烯酸甲酯75mL,邻苯二甲酸二丁酯25mL;Ⅱ液:在Ⅰ液的基础上加过氧化苯甲酰1g;Ⅲ液:在Ⅰ液的基础上加过氧化苯甲酰2.5g。以上三液,用磁力搅拌器充分搅匀。标本在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ液各浸透36h。在青霉素小瓶中注入约5mL的Ⅲ液,将标本按同一方向放入瓶中,然后置于40℃烘箱中聚合3～4d,待变为无色透明的坚硬包埋块后,砸碎小瓶,取出包埋块。修块后,在切片机上,用钨钢刀分别切出5μm的纵向不脱钙骨切片。一片用二甲苯溶掉树脂后,梯度乙醇至水,甲苯胺蓝染色,观察静态指标;另一片直接在荧光显微镜下做动态指标测定,观察。1.2.4观测指标按谢雁鸣等人的方法,采用LeicaQwin图象分析系统进行骨组织形态计量。1.2.4.1骨小梁组织形态计量:①骨小梁体积百分比(TBV%):骨小梁体积/被测骨髓腔总体积×100%,是骨量水平的主要标志;②骨小梁吸收表面百分比(TRS%):不规则、凹凸不平的骨小梁表面/骨小梁表面×100%;③骨小梁形成表面百分比(TFS%):有成骨细胞被覆的类骨质表面/骨小梁表面×100%;④活性生成表面百分比(AFS%):有荧光标记带的骨小梁表面/骨小梁表面×100%;⑤骨小梁矿化率(MAR):骨小梁表面荧光双标记带的平均距离/两次标记相隔的天数;⑥骨小梁骨生成率(BFR):AFS%×MAR。1.2.4.2皮质内表面形态计量:①类骨质平均宽度(OSW):皮质内表面类骨质的平均宽度;②骨皮质矿化率(mAR):皮质内表面双标记带的平均距离/两次标记相隔的天数。1.2.5统计学处理数据以x¯±sx¯±s表示,用SPSS12.0软件进行分析。各组间比较采用单因素方差分析,样本均数间的两两比较采用LSD-t检验。2结果2.1trs%和trs%对大鼠trs%的影响结果可见,去卵巢模型组大鼠TBV%较假手术组大鼠明显降低(P<0.01),TRS%较假手术组大鼠明显升高(P<0.01);乌鸡白凤丸组大鼠TBV%明显较去卵巢模型组大鼠升高(P<0.01),TRS%明显较去卵巢模型组大鼠降低(P<0.05或P<0.01),见表1。2.2假手术组和假手术组大鼠r比较结果可见,去卵巢模型组大鼠TFS、AFS、MAR和BFR均较假手术组大鼠明显升高(P<0.01);乌鸡白凤丸组大鼠TFS%、AFS%、MAR、BFR均明显较去卵巢模型组大鼠降低(P<0.05或P<0.01),见表2。2.3高p>0.1结果可见,去卵巢模型组大鼠OSW、mAR较假手术组大鼠、明显升高(P<0.01);乌鸡白凤丸组(1.0g/kg、2.0g/kg、4.0g/kg)组大鼠胫骨OSW、mAR明显较去卵巢模型组大鼠降低(P<0.05或P<0.01),见表3。3鸡白凤丸的病理改变骨组织显微结构的改变是导致骨质疏松症及并发骨折的重要病理环节,骨组织形态计量学指标是直接反映骨形成与骨吸收的重要指标,也是评估骨转换状态和骨质疏松程、诊断分型及确定疗效的重要指标。祖国医学认为:“肾藏精,主骨生髓。”妇女绝经后,肾气渐衰,肾精虚少,骨髓化源不足,不能营养骨骼,进而导致骨骼脆弱无力,出现腰脊酸软疼痛,下肢乏力,遇外力易发生骨折等骨质疏松症状。中西医结合对肾本质的研究表明:肾虚时有下丘脑—垂体—性腺轴功能减退,雌激素分泌减少。可见,中医的肾虚是绝经后骨质疏松症的主要病理生理学基础。众多医家对骨质疏松症进行辨证时发现,肾虚是其主要病机,但往往多伴有脾虚、血瘀之征。脾主运化,脾胃虚弱,水谷摄入不足,气血生化之源溃乏,后天之精不能滋养肾水、肾精,致使筋骨失养,所以在补肾的同时也应顾及对脾胃的培养。肾中精血不足,不能充骨生髓,筋骨失养,复感寒湿,凝滞筋骨,使气血痹阻,不通则痛,故在补肾的同时也应适当理气活血。乌鸡白凤丸源于《普济方》,是妇科常用调经之方。方中甘温的熟地黄与咸寒的鳖甲以滋补肾阴;乌鸡、鹿角胶、鹿角霜以温壮肾阳,四药合用以温补下元为君。桑螵蛸、牡蛎、芡实助阳益火,桑螵蛸经冬之阴,又迎来年春天少阳升发之气,可引火归元,使浮阳返归于肾;白芍、天冬滋阴壮水,敛阴以涵阳,共为臣药,稳固下元。佐以人参、黄芪大补脾肺气,以资气血生化之源,配伍当归养血和营,使所补的无形之气依附有形之血,解除血虚阳浮,阴不维阳之虞;川芎与归、芍、熟地组成四物汤,再配伍丹参养血活血,香附疏肝理气,使气行血活;山药健脾化湿,祛生痰之源;银柴胡敛阴退虚热,透其不尽之邪,使风无留着,至此,引动内风的诱因随之云散。甘草固守中州,调和诸药为使药。诸药合用,使下元稳固,虚阳得潜。本实验采用6月龄SD大鼠摘除卵巢复制绝经后骨质疏松症模型,研究结果显示,大鼠切除卵巢