氯虫苯甲酰胺在大豆中的内吸传导特性

氯虫苯甲酰胺在大豆中的内吸传导特性

0对肌肉的危害氯霉苯甲酮是美国杜邦公司2000年开发的一种高效、低毒相邻甲基苯基甲酮酯中毒。它具有高效、低毒、广、环境相同的特点。对大多数水稻、棉花等作物的有害蛾和一些害虫有良好的抗性。氯虫苯甲酰胺对害虫具有新颖的作用机制,通过激活兰尼碱受体,释放平滑肌和横纹肌细胞内贮存的钙,引起肌肉调节衰弱、麻痹,直至害虫死亡;作用方式为胃毒和触杀作用。氯虫苯甲酰胺可有效防治已对其它杀虫剂产生了抗性的害虫,对非靶标节肢动物具有良好的选择性,从而能有效地保护天然寄生蜂、天敌和传粉昆虫。【前人研究进展】氯虫苯甲酰胺5.0%悬浮剂(普尊)和200g·L-1悬浮剂(康宽)主要用于防治蔬菜害虫甜菜夜蛾、小菜蛾等和水稻害虫稻纵卷叶螟等,目前关于氯虫苯甲酰胺的研究主要集中在氯虫苯甲酰胺对害虫的作用机制、杀虫谱、田间防治效果及氯虫苯甲酰胺制剂有效成分、其在部分水果蔬菜、水体及土壤等环境介质中的残留等方面。【本研究切入点】药剂在植株体内吸传导特性是植物化学防治理论与实践中最备受关注的问题,对探明药剂对害虫的作用方式、在受体植物中的富集部位、持效时间、代谢过程和残留动态等毒理学行为和指导田间科学用药具有重要的意义。而目前氯虫苯甲酰胺在植株体内的内吸传导特性尚无相关研究报道。【拟解决的关键问题】本研究拟采用大豆植株作为试验材料,借助相关研究的成功经验,深入系统地研究氯虫苯甲酰胺在大豆植株中的内吸传导路径,为制定利用氯虫苯甲酰胺防治蔬菜、水稻等害虫施药策略提供重要的科学依据。1材料和方法1.1s型电子天平/25和5.LCQDecaXPMAX型高效液相色谱仪(带二极管阵列检测器):美国Thermo公司;BS210S型电子天平(1/万),德国Sartorius公司;SB-1000型旋转蒸发器,日本Eyela公司;THZ-82A型振荡机,江苏富华仪器有限公司。氯虫苯甲酰胺标准品(w=99.0%),美国Chemservice公司提供;乙腈(色谱纯):美国Merck公司;试验用蒸馏水经0.45μm的微孔滤膜过滤后使用。1.2利用营养液培养大豆幼苗在扬州大学园艺与植物保护学院盆栽网室内栽种大豆(Glycinemax(L.)Merrill),待长至2—3叶期时将大豆幼苗移栽至人工气候培养箱利用营养液培养,试验时间为2009年5月至2009年7月。大豆植株营养液配方参考童学军等的方法配制,人工气候箱内温度变化为25—32℃,相对湿度65%—72%,光照强度1000lux,光照周期L﹕D=12h﹕12h,长至6—8叶期时供内吸传导性试验。1.3测试方法1.3.1柱温度和流速液相检测条件为:色谱柱:HPODSHypersi150mm×4.0mm(i.d.),5μm;柱温:室温;流动相:乙腈﹕水=65﹕35(V﹕V);流速:1.0mL·min-1;检测波长:268nm;进样量:10μL,采用外标峰面积定量。1.3.2样品的制备分别称取5.0g大豆叶片和茎杆植株于匀浆杯中,再加入30mL乙腈,使用匀浆机将大豆叶片和茎杆分别捣碎,在匀浆器上高速匀浆3min,在捣碎的各处理样品中加入氯虫苯甲酰胺溶液,使各样品中氯虫苯甲酰胺的添加浓度分别为5.00、1.00和0.10μg·g-1,同时设置空白对照,每处理重复3次。方法的准确度以全过程标准添加回收率来衡量,方法的精确度以测定结果的变异系数来衡量。1.3.3硫酸钠与无铅硫酸钠的萃取在1.3.2各处理中加入不同浓度的氯虫苯甲酰胺后的各匀浆液中,再分别加入1.5g氯化钠和6g无水硫酸钠,涡旋振荡,在4000r/min离心5min。取上清液并加入乙腈并定容到5.0mL,混匀后,过0.45μm有机相滤膜,待HPLC检测分析。1.3.4大豆叶片的处理称量0.1010g氯虫苯甲酰胺,加入5mL的N,N-二甲基甲酰胺溶解,再加入N,N-二甲基甲酰胺定容至50mL,配制2000μg·mL-1的氯虫苯甲酰胺母液,在4℃冰箱中保存,备试验用。分别取氯虫苯甲酰胺母液10、2.5mL,加入已配制好的营养液中,同时加入0.5mL吐温-80,加入营养液,混合均匀,使其最终体积为100mL,使营养液中氯虫苯甲酰胺的终浓度分别为200和50μg·mL-1。将6—8叶的大豆植株苗移到营养液中进行培养,大豆的根须全浸没在营养液体中(施药部位方式见示意图1中部位a)。每盆种植3株大豆苗,待培养24和48h后,从营养液中取出大豆苗,并将大豆苗在营养液面以下的部位全部去掉,分别收集营养液以上的大豆茎杆和大豆叶片,每处理3个重复。对照处理组的营养液中含有与处理组同样含量的N,N-二甲基甲酰胺和吐温-80。分别称量上述的大豆茎杆和大豆叶片各5g,捣碎后,加入乙腈溶剂,按照1.3.2和1.3.3的方法处理,测定茎杆和叶片中氯虫苯甲酰胺的含量。1.3.5树叶片、涂药叶片的现场涂药和涂膜取配制好氯虫苯甲酰胺母液5mL,加入营养液后,再加入0.5mL吐温-80,加入营养液,使其最终体积为100mL,混合均匀,溶液中氯虫苯甲酰胺的终浓度为100μg·mL-1。取在塑料盆中种植的大豆植株进行内吸传导性试验,在大豆植株的不同部位的叶片进行涂布药液,具体的操作方法如下。(1)植株茎杆中部成熟叶片涂药用毛笔将已配制好的100μg·mL-1的药液涂布在大豆植株的中部生长的成熟叶片上,在涂布过程中,用毛笔轻轻将药剂缓慢地涂布在叶片上,待叶片上液滴变干后,再涂布一定的药剂,重复3次。同时为防止叶片上涂布的药滴滴落到其它叶片或者土壤中,在涂药过程中使用保鲜膜将下面不涂布的叶片和土壤盖住,待叶片的药剂完全干后,取走保鲜膜(施药部位方式见示意图1中部位b)。涂布24和48h后分别取涂布药剂后的成熟叶片、涂药叶片以上部位的叶片、涂药部位以下部位的叶片,待前处理后,HPLC检测分析各采集部位中氯虫苯甲酰胺的含量。(2)植株顶端生长点叶片涂药用毛笔将已配制好的药剂均匀涂布在大豆顶端生长点的叶片上,涂药方法同茎杆中部成熟叶片涂药方法(施药部位方式见示意图1中部位c)。24和48h后取已涂药剂的生长点处叶片、生长点以下部位的叶片,待前处理后,HPLC检测分析所采集部位中氯虫苯甲酰胺的含量。2结果2.1酰胺的质量浓度在1.3.1给定的高效液相色谱操作条件下进样10μL,以氯虫苯甲酰胺的质量浓度为x轴、响应值峰面积为y轴绘出标准曲线。氯虫苯甲酰胺在113.75—0.1088μg·mL-1的范围内呈线性关系,线性方程为y=78310x+18215,相关系数为0.9999。2.2添加回收率和变异系数在不同的添加质量分数下,大豆茎杆中氯虫苯甲酰胺的添加回收率和变异系数分别是83.79%—93.80%和1.45%—3.46%;叶片中添加回收率和变异系数分别是83.85%—92.18%和1.77%—3.89%;大豆各部位中氯虫苯甲酰胺的添加回收率和变异系数在允许范围内,符合农药残留分析的要求。2.3甲酰胺残留检测氯虫苯甲酰胺标准品、大豆空白样品和大豆处理样品各部位中氯虫苯甲酰胺残留检测的高效液相色谱典型色谱图见图2—图6,在给定的液相色谱条件下,分离效果良好。氯虫苯甲酰胺在给定的液相色谱检测条件下的保留时间为2.95min左右。此方法简便可靠。2.4大豆叶片中含量的确定采用水培法处理时,当培养液中氯虫苯甲酰胺的浓度为50μg·mL-1时,24和48h后大豆茎杆中的含量分别为15.22和8.71μg·g-1,大豆叶片中的含量分别为4.73和7.96μg·g-1;当培养液中氯虫苯甲酰胺的浓度为200μg·mL-1时,24和48h后大豆茎杆中的含量分别为18.52和16.45μg·g-1,大豆叶片中的含量分别为11.95和17.88μg·g-1(表1)。2.5根据涂料法研究了氯丙烯酸苯甲酮胺对大豆植物的内吸传导性试验结果2.5.1成熟叶片的遗传稳定性采用浓度100μg·mL-1涂药处理大豆成熟叶片时,24和48h检测发现,成熟叶片以上部位叶片中氯虫苯甲酰胺的含量分别为16.55和20.79μg·g-1(表2),成熟叶片以下部位未检测出氯虫苯甲酰胺。结果表明,氯虫苯甲酰胺在大豆植株中具有较好的自下而上的内吸传导性。2.5.2涂药处理大豆生长点叶片后氯虫苯甲酰胺在大豆植株各部位中内吸传导性试验结果在大豆顶端生长点叶片涂抹浓度100μg·mL-1时,在生长点以下的部位叶片中均未检测出氯虫苯甲酰胺的存在(表3),说明氯虫苯甲酰胺不能通过大豆的韧皮部自上而下在植株体内内吸传导。3安全防范害虫的重要作用氯虫苯甲酰胺是一种微毒农药,对人等哺乳动物的毒性极低,对鱼虾等水生生物以及蜜蜂、害虫天敌如捕食螨基本没有毒性,而对鳞翅目害虫具有较高的活性;氯虫苯甲酰胺可用于防治水稻稻纵卷叶螟、三化螟、二化螟、小菜蛾、斜纹夜蛾、甜菜夜蛾、豆荚螟、玉米螟等几乎所有鳞翅目害虫。本研究表明,氯虫苯甲酰胺具有优异的内吸传导特性,施用到作物上后,可以很快被植株吸收,在植株体内可以自下向上传导至作物的各个部位,从而全面有效地保护作物。由于具有优异的内吸性,杀虫活性又极高,使其药效期很长,可以有效杀死高龄害虫。同时农民使用也非常简便,用于防治小菜蛾、斜纹夜蛾、甜菜夜蛾,只正面均匀喷雾蔬菜叶面即可达到较好的防治效果。目前,关于氯虫苯甲酰胺的残留与环境毒理学研究主要集中在氯虫苯甲酰胺几种环境介质中(土壤、水体和部分蔬菜)的残留提取分析方法上[18,19,20,21,22,23],没有涉及到氯虫苯甲酰胺在植株中的内吸传导规律。本研究表明氯虫苯甲酰胺在大豆植株内具有优异的自下而上的内吸传导特性,而不能自上而下地在植株体内传导,在防治地下害虫或者钻蛀性害虫时,采用植株叶面喷雾的方式处理时,不能完全发挥氯虫苯甲酰胺的药效;因此在制定此类害虫防治策略时,可以考虑施用氯虫苯甲酰胺可分散粒剂、颗粒剂,或者结合土壤处理的方式进行。在中国,氯虫苯甲酰胺主要登记在甘蓝和水稻上,用来防治甜菜夜蛾和稻纵卷叶螟等害虫,而笔者以大豆作为试验材料研究氯虫苯甲酰胺在植株的内吸传导特性,主要考虑到大豆植株的叶片分布特点和生长特点,及已有的以大豆植株作为试验材料,研究氟虫腈、三唑酮及其类似物的内吸传导特性的研究报道。在更进一步的研究中,将采用甘蓝和水稻苗作为供试材料,深入系统研究氯虫苯甲酰胺在受体植物中的内吸传导特性,为合理使用氯虫苯甲酰胺防治蔬菜、水稻等害虫策略的制定提供科学依据。4培养液中氯虫苯甲酰胺含量的测定以乙腈为提取溶剂,采用超声波提取大豆植株中的氯虫苯甲酰胺,由带二极管阵列检测器高效液相色谱检测分析氯虫苯甲酰胺在大豆植株的系统分布,方法简便可靠。采用水培法处理时,当培养液中氯虫苯甲酰胺的浓度为50μg·mL-1时,24h后大豆茎杆和叶片中的含量分别为15.22和4.73μg·g-1,48h后大豆茎杆和叶片中的含量分别为8.71和7.96μg·g-1;当培养液中氯虫苯甲酰胺的浓度为200μg·mL-1时,24h后大豆茎杆和叶片中的含量分别为