全蝎蛋白药效组分对bel7202细胞凋亡的影响

全蝎蛋白药效组分对bel7202细胞凋亡的影响

所有蝎子都是动物东方蝎子的干燥身体。这是一种常见的动物性中药（2005年的《中国药典》）。最早出现在开宝草本植物，疗效准确。但质量标准中一直缺少与临床疗效对应的品质鉴定的科学指标和方法。本文以中药药效组分理论为基础,结合全蝎攻毒散结的功效,通过对全蝎蛋白药效组分的研究,初步确定了全蝎蛋白药效组分对肿瘤细胞Bel7402的细胞毒和细胞周期抑制作用。1材料表面东亚钳蝎药材,购于河北安国药材市场,由北京中医药大学张贵君教授鉴定。1.1全蟹蛋白的合成全蝎粉末,蒸馏水浸提4h,取上层淡黄色提取液,抽滤得淡黄色透明液体,重复试验直到硫酸铵盐析试验呈阴性为止,浓缩,硫酸铵盐析。纯化后的蛋白质溶液进行冷冻干燥,最终获得全蝎蛋白药效组分。称取适量供试品,加不含胎牛血清的RPMI-1640培养液溶解,0.22μm孔径滤膜过滤除菌。4℃保存备用。1.2反渗纯水试验二氧化碳培养箱(Heraeus,德国);USAMILLIPORE反渗纯水仪;450型酶标比色仪(BioRad,美国);FACSCalibur流式细胞仪(BeckonDickinson,美国)等。1.3pi、rhodamin-1,4,3,4-特胎牛血清(杭州四季青公司);胰蛋白酶(Gibco公司);台盼蓝(trypanblue),碘化丙锭(propidiumiodide,PI)(美国Sigma公司);青霉素、链霉素(华北制药股份有限公司);Rhodamin123(法国Biotium公司);罗丹明(SRB,美国Amresco公司);RNAaseA(上海生工科技有限公司)等。1.4细胞植物2方法2.1蝎子全效物质的制备2.2肿瘤细胞培养、毒性和生长抑制试验2.2.1细胞培养人肝癌细胞株(Bel7402),培养液为含10%胎牛血清的RPMI-1640。按照常规法培养细胞,台盼蓝染色计数后分传至数个培养瓶。2.2.2细胞培养和测定取对数生长期Bel7402细胞,用0.25%胰酶与0.02%EDTA等量混合的消化液消化配成单细胞悬液,用RPMI-1640完全培养基(含5%胎牛血清)稀释至细胞密度为1.3×105个/mL。取灭菌后的96孔板,细胞悬液摇匀后,每孔加入细胞悬液150μL。设空白对照组(加等体积生理盐水)和6个质量浓度的试验组,每组6个重复孔。加样完毕后,将上述培养板置于含5%CO2及100%湿度的37℃恒温箱中培养48h。2500r·min-1,离心15min,吸去有血清培养基,每孔加入无血清RPMI-1640培养基200μL。在Bel7402的培养板中每孔加入预冷的50%三氯乙酸(TCA)50μL(TCA最终浓度为10%),4℃冰箱中固定1h。倒掉固定液,小孔用去离子水洗5遍,甩干,空气干燥。每孔加入50μL0.4%罗丹明(SRB)染色,室温放置30min。未与蛋白结合的SRB用1%乙酸洗5次,空气干燥。结合的SRB用10mmol·L-1100μL非缓冲Tris碱液(pH10.5)溶解。摇床振荡混匀5min。在酶标仪上以试验波长570nm,参比波长450nm,测定吸光度(A)。绘制细胞生长曲线,并按以下公式计算细胞生长抑制率(IR)。2.2.3细胞pbs和rnaasea检测细胞数同2.2.2项,取灭菌后的6孔板,细胞悬液摇匀后,每孔加入细胞悬液1500μL。设空白对照组(加等体积生理盐水)和5个浓度的试验组,每组3个重复孔。加样完毕后,将上述培养板置于含5%CO2及100%湿度的37℃恒温箱中培养48h。用0.25%胰酶与0.02%EDTA等量混合的消化液消化配成单细胞悬液,离心收集细胞,PBS洗1次,离心弃PBS,用剩余的PBS充分混匀细胞,加入-20℃预冷24h的70%乙醇,混匀,封口,4℃过夜。1000~1200r·min-1离心10min,弃去70%乙醇,每支管中加入2mLPBS,振荡器清洗混匀,1000r·min-1离心5min。倒出PBS,每支管中加入200μLPBS,20μLRNAaseA(终浓度为50mg·L-1),振荡器混匀,37℃消化40min。每支管加入碘化丙锭(propidiumiodidePI,终浓度为50mg·L-1),振荡器混匀,冰箱避光放置4℃染色1h。用尼龙网过滤,上机测试。以直方图(横坐标为DNA相对含量,纵坐标为细胞数)表示测定结果。比较对照组和试验组细胞群体的比例,即可判断药物对细胞周期的影响。2.2.4统计方法采用F,q,χ2检验,并做剂量效应和时间效应的直线回归和相关分析(相关系数用t检验),对数概率单位法求IC50。3结果3.1代谢能力下降全蝎蛋白药效组分处理Bel7402细胞后,细胞代谢能力下降,细胞毒性明显。全蝎蛋白药效组分对Bel7402细胞的剂量效应关系显著(表1,相关系数为0.9125,IC50为241g·L-1)。3.2可减少bel492c细胞凋亡的药物因素对照组细胞没有凋亡,细胞生长良好。流式细胞试验结果显示,经全蝎蛋白药效组分处理的Bel7402细胞48h,Bel7402细胞呈现凋亡所特有的亚G1峰,而且细胞凋亡率随药物剂量的增加而增高,说明全蝎蛋白药效组分对Bel7402细胞具有促进凋亡的作用(表2)。4体外试验结果在MTT法试验中,用MTT染色后测定吸光度A时,蛋白质成分会影响A,无法从A方面检测全蝎蛋白药效组分的抗肿瘤活性。但显微镜下观察时,从24h起,在高剂量的试验组就已经发生了细胞凋亡,至48h时低剂量组的细胞也发生了凋亡,镜下观察全蝎蛋白药效组分有抗肿瘤活性。因此,试验时采用MTT法的试验方法,但是将染色剂换成受蛋白质影响较小的罗丹明染色剂,并且增加脱色步骤的方法进行试验,得到较好的试验结果,A与镜下观察的细胞凋亡程度相统一。本研究用全蝎蛋白药效组分对肿瘤细胞Bel7402的体外试验研究表明,当浓度在37g·L-1以上时,对癌细胞有明显抑杀作用且抑杀效果与剂量呈线性正相关,相关系数为0.9125,其IC50为241g·L-1,在一次给药后48h内有显著的抑杀作用,说明全蝎蛋白药效组分在体外有稳定抑杀癌细胞的特点。在流式细胞试验中,经全蝎蛋白药效组分处理Bel7402细胞48h后,细胞呈现凋亡所特有的亚G1峰,而且细胞凋亡率随药物浓度的增加而增高,但细胞的增值率与药物浓度无明显差异。试验结果表明,当全蝎蛋白药效组分含量高于9.25g·L-1时,能显著增加Bel7402细胞