鸡脂肪酸结合蛋白基因克隆及初步表达分析

鸡脂肪酸结合蛋白基因克隆及初步表达分析

在现代鸡生产中，90%以上的商品鸡是混合鸡。通过品种间杂交、配套系杂交等方式获得的商品代肉鸡体型整齐、肉用性能好,但杂种鸡腹脂和皮下脂肪含量过高问题却日显突出。适当的脂肪储备为鸡的正常生理及代谢所必需,但腹部和皮下脂肪沉积过多则不利于鸡的生长发育且增加饲料消耗。脂肪酸结合蛋白(Fattyacidbindingprotein,FABPs)是一族小分子细胞内蛋白质,含126~134个氨基酸序列。FABPs广泛存在于各种动物组织中,与长链脂肪酸有较高亲和力,对脂肪酸的氧化、脂化和代谢起重要作用。迄今已发现15种类型的FABPs,肝脏脂肪酸结合蛋白(L-FABP)是最早发现的FABP,也称FABP1。目前报道较多的是心型FABP(H-FABP)、脂肪型FABP(A-FABP)和细胞外FABP(Ex-FABP)。对大鼠的研究发现,H-FABP和A-FABP是影响肌间脂肪含量的重要基因。Gerbens等对猪H-FABP基因的研究发现,不同基因型个体的肌间脂肪含量差异显著,并认为H-FABP基因可能是影响猪肉肌间脂肪沉积的主效基因。对鸡的研究发现,Ex-FABP基因的单核苷酸多态性与腹脂性状相关显著[5~8]。L-FABP的功能研究主要集中在人与小鼠。对小鼠的研究表明,L-FABP与不饱和脂肪酸的协同作用可有效促进细胞的生长和分化。L-FABP还参与胰岛素信号传导,促进血红素和硒的代谢,以及甾醇的合成。Schroeder等研究发现,L-FABP基因的表达与胚胎干细胞的增殖分化密切相关。近年来对小鼠的研究表明,L-FABP与H-FABP、A-FABP相似,对直链和支链脂肪酸的吸收和代谢起重要作用。目前有关鸡L-FABP基因的相关报道较少。Wang等研究发现,鸡L-FABP基因为组织特异性表达基因,只在肝脏及小肠部位表达。通过关联分析显示,鸡L-FABP基因的单核苷酸多态位点与中国农大CAU-F2鸡群的腹脂重及腹脂率呈显著相关,表明L-FABP基因可能是鸡腹脂性状的候选基因或与其主效基因连锁。为寻找与杂种鸡脂肪性状表达密切相关的基因,本研究以纯种丝羽乌鸡、农大褐蛋鸡及其正反杂交组合鸡为试验对象,分析了8周龄杂种鸡的腹脂重、肌间脂宽等性状与双亲均值的差异,通过mRNA差异显示技术(DifferentialDisplayRT-PCR,DDRT-PCR)及测序获得了在杂种鸡中高表达的鸡L-FABP基因,利用Northern杂交等方法验证了L-FABP基因在杂种鸡肝脏组织中的高表达现象,进而对鸡L-FABP基因表达量与杂种鸡脂肪沉积性状间的关系进行了探讨和分析。1材料和方法1.1杂交组合cd和dc以纯种丝羽乌鸡(Silkie,CC)、农大褐蛋鸡(CAUBrown,DD)及其正反杂交组合(CD和DC)为材料,每个组合200余只鸡,公母各半,相同条件饲养于中国农业大学国家家禽性能测定中心。至8周龄,分别从4组鸡中随机抽取30只健康公鸡进行屠体性能测定,并从每组鸡中随机抽取8只采集新鲜肝脏组织,置于液氮速冻后再冻存于–80℃备用。1.2方法1.2.1dna的合成肝脏组织的总RNA用TRIZOLkit提取(参照Invitrogen公司提供的方法)。总RNA纯化后,每个组合8个样本的总RNA等量混合建RNA池。反转录合成第一链cDNA,反应体系20µL,包括:0.5µg总RNA池,50mmol/LTris-HCl(pH8.3),40mmol/LKCl,7mmol/LMgCl2,10mmol/LDTT,20mmol/LdNTP,200pmol/L的3′锚定引物(HT11A:5′-AAGCTTTTTTTTTTTA-3′)。反转录条件为,65℃5min,37℃10min后加入100U的MMLV反转录酶(Promega),37℃继续温育1h,75℃5min。1.2.2dntp的制备DDRT-PCR反应体系为20µL,包括2µL反转录产物,10mmol/LTris-HCl(pH9.0),50mmol/LKCl,1.5mmol/LMgCl2,20mmol/LdNTP,200pmol/L3′锚定引物(HT11A:5′-AAGCTTTTTTTTTTTA-3′),200pmol/L5′引物(简并引物GF-1:5′-GAGT\CCCA\GGACATTGAGCAG-3′),1UTaqDNA聚合酶(Promega)。反应条件为,94℃预变性5min,前25个循环94℃30s,40℃60s,72℃90s,后15个循环94℃30s,52℃60s,72℃90s,最后72℃延伸7min。DDRT-PCR扩增产物检测用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶(39:1)电泳,银染法显色。1.2.3差异片段的回收银染显色后立即从PAGE胶上切下差异表达片段,装入1.5mL灭菌eppendorf管,加入100μLNaI溶液,1/30体积TBE,37℃摇床振荡2~3h,再用Glassmilk试剂盒(Bio101)方法回收差异片段。回收产物用于二次PCR扩增,扩增条件与第一次PCR条件一致,扩增产物用Glassmilk试剂盒回收。二次扩增产物回收后与pMD18-T载体连接,转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞克隆,用DyeTerminatorCycleSequencingKit进行测序反应,在ABIPrism377DNA测序仪进行正反向测序。1.2.4半定量rt-pcr扩增利用地高辛标记试剂盒(Roche公司),将含目的基因片段的重组质粒标记为探针,与点于尼龙膜上的4个组合鸡肝脏cDNA(50ng)进行反向Northern杂交,杂交步骤参照试剂盒方法进行。根据本研究获得的鸡L-FABP基因的cDNA序列设计一对特异性引物,同时选用组成型表达基因GAPDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶)作为内参照,进行半定量RT-PCR扩增。其中,目的基因L-FABP上游引物序列为:5′-GCAGAATGGGAATAAGTTC-3′;下游引物:5′-ATTCTCTTGCTAATTCTCTTG-3′。内参照基因GAPDH的上游引物:5′-TCACAAGTTTCCCGTTCTCA-3′;下游引物:5′-GGAACACTATAAAGGCGAGAT-3′。半定量RT-PCR反应体系25µL,包括1µL反转录产物,10mmol/LTris-HCl(pH9.0),50mmol/LKCl,1.5mmol/LMgCl2,20mmol/LdNTP,目的基因L-FABP及内参照基因GAPDH的上、下游引物各200pmol/L,1UTaqDNA聚合酶(Promega)。目的基因和内参照基因的扩增循环数均确定为指数扩增期内的第23个循环,扩增条件为,94℃预变性5min,94℃30s,52℃30s,72℃45s,循环数23,72℃延伸7min,最后4℃保存。1.2.5各性状优势率收集8周龄CC、DD、CD及DC四组鸡30只公鸡的屠体性能测定数据,对腹脂重、肌间脂宽、胸肌重、腿肌重、翅重、半净膛重、全净膛重、体斜长、胫骨长等9个性状的杂种优势进行分析,各性状杂种优势率计算公式为:性状杂种优势率(%)=((性状杂种表型–亲本均值)/亲本均值)×100。2结果与分析2.1鸡l-fabp基因的扩增与同源性分析DDRT-PCR电泳图谱显示,8周龄丝羽乌鸡(CC)、农大褐蛋鸡(DD)及其正反杂交组合鸡CD和DC肝脏组织含一条差异表达的片段(图1A)。可以看出,杂交组合CD、DC及纯种农大褐DD均有一条约300bp的扩增片段,另一亲本丝羽乌鸡CC该片段扩增不明显。对此差异表达片段进行回收克隆及测序,发现该片段与鸡肝脏cDNA库中的EST及cDNA序列(AW198465、EU049889、AF380999和AF563636)高度同源。基于此,根据人与鸡的高度保守区设计引物,扩增出鸡L-FABP基因的cDNA序列517bp,该序列包含鸡L-FABP基因的全长cDNA编码序列,共计381bp。序列比对表明,鸡L-FABP基因与人L-FABP基因的同源性为73.44%。据cDNA开放阅读框序列翻译氨基酸,鸡L-FABP基因共编码127个氨基酸,与人的氨基酸序列比对显示,二者同源性为70.08%。向GenBank提交鸡L-FABP基因的全长cDNA编码序列及氨基酸序列(GenBank登录号:AY321365)。2.2重组质粒的制备为验证DDRT-PCR中发现的L-FABP基因在4个组合鸡肝脏组织中确实存在差异表达,本研究首先进行了反Northern杂交验证。其中探针为含有L-FABP基因片段的重组质粒,膜上为4个组合鸡的cDNA,并以制备探针的重组质粒为阳性对照(+)进行杂交(图1B)。杂交结果与DDRT-PCR结果相似,表现为杂交组合鸡DC、CD的L-FABP基因表达量高于亲本纯种鸡DD和CC的表达量。再以鸡L-FABP基因的特异引物进行半定量RT-PCR验证,结果如图1C显示,杂交组合鸡CD和DC的L-FABP基因表达量(相对于GAPDH分别为1.357、1.4)高于亲本纯种CC及DD(相对于GAPDH分别为1.174、0.907)的表达量。进一步验证了L-FABP基因在杂种鸡CD、DC肝脏组织中的表达量高于亲本纯种鸡CC和DD的表达量。2.3粗鱼血食蛋白的表型八周龄鸡的屠体性能杂种优势分析结果表明,除翅重外,杂种鸡CD和DC的各项屠体性状表型均高于亲本丝羽乌鸡CC及农大褐蛋鸡DD的均值。其中,杂种鸡CD、DC的腹脂重超出双亲均值最高,杂种优势率分别达70.53%和41.41%,肌间脂宽也较高,杂种优势率分别为21.31%和8.2%,比其余6个屠体性状高出约2~16倍(表1)。3l-fabp基因丝羽乌鸡(CC)是我国著名本地鸡品种,其肉及蛋在抗氧化、抗衰老及滋阴补气等方面具有独到功效。农大褐蛋鸡(DD)是我国自主培育的蛋鸡品种,具有适应性强、耗料少、产蛋多等特性。本研究通过这两个品种的正反杂交试验发现,杂种鸡CD、DC的腹脂重和肌间脂宽比双亲均值高8.2%~70.53%,这与肉鸡生产中发现的杂种鸡存在腹脂和皮下脂肪含量过高的现象一致。肝型脂肪酸结合蛋白(L-FABPs)是FABPs家族成员之一,在长链脂肪酸的运输、代谢、细胞膜磷脂构建及机体能量供应等方面具有重要作用[9~14]。适量表达的长链脂肪酸为动物机体所需,而表达水平过高时,则对细胞产生毒性作用,L-FABPs可与这些有潜在毒力的长链脂肪酸相结合,或者将它们运输到线粒体以氧化降解,或者将之运输到内质网等储脂器官沉积下来。最近,Martin等对L-FABP基因敲除小鼠的研究表明,敲除L-FABP基因会引发小鼠肥胖症,且为年龄和食物依赖型肥胖症。与年龄和食物密切相关的人的肥胖症也发现相似现象。据Spann等报道,小鼠L-FABP与甘油三脂转移蛋白(triglyceridetransferprotein)协同作用,促进脂肪酸转化为甘油三脂,并使油脂转化为极低密度脂蛋白(VLDL)。本研究发现,鸡肝脏组织L-FABP的氨基酸序列及结构与人和大鼠的L-FABP极为相似,与Sewell等研究结果一致。Wang等研究结果表明,鸡L-FABP基