茶叶中黄酮类物质的分离与鉴定

茶叶中黄酮类物质的分离与鉴定

儿茶素是茶叶中含量丰富、功能重要的一重要物质。这些成分主要包括儿茶素（ce）、儿茶素无酸酯（ceg）、儿茶素无酸酯[（-）-ecgg]等。（-）-ecgg是儿茶素中最有效的活性成分，约占绿茶重量的8%13%，也是儿茶素中含量最高的成分。(-)-EGCG是α-连苯酚基苯并吡喃与没食子酸形成的酯,具有酚类抗氧化的通性,其分子结构中有6个邻位的酚羟基,因此有优于其它儿茶素的许多性质。并具有抗菌消炎、抗氧化和抗突变的作用,也可用作为肿瘤多药耐药性的逆转剂,能够改善癌细胞对化疗的敏感性,减轻对心脏的毒性,还有保护内皮的作用,可以有效促进血管舒张,减少心血管疾病的发生。高纯度(-)-EGCG与茶多酚提取物相比,具有有效成分明确、没有杂质副作用干扰、活性更强等优点,因此分离纯化(-)-EGCG具有重要意义。目前,(-)-EGCG的主要分离方法主要有HPLC分离、葡萄糖凝胶分离、超临界流体萃取、柱层析法等。由于吸附型填料价格便宜,具有吸附能力强、解吸容易、稳定性高、可再生、反复使用等优点,本文在前人的研究基础上,使用聚酰胺为柱色谱填料,对茶叶中(-)-EGCG的分离、纯化工艺条件进行优化实验。1材料和方法1.1ecgg-2-仪器绿茶安徽天方茶叶公司;聚酰胺粒径60~90目,江苏临江化工试剂厂;活性炭粉末;乙酸乙酯色谱纯;(-)-EGCG标准品长沙华欣科技公司;冰醋酸优级纯;98%乙醇。玻璃层析柱规格500mm×20mm,定制;旋转蒸发器Waters600型高效液相色谱仪(HPLC);UV2300紫外分光光度仪上海天美科学仪器有限公司;Nicolet6700傅立叶红外光谱仪,POLAX-2L旋光仪。1.2实验方法1.2.1浓缩提取液的制备将10g茶叶在烤箱中进行烘干后碾成碎末状,在漏斗出口堵上脱脂棉后,将茶叶装入恒压滴液漏斗中,并向其中装入无水乙醇。使用循环冷凝装置并用水浴加热,温度在87℃左右。当有冷凝液滴出时,开始计时,2h后,改换蒸馏装置浓缩提取液。向提取液中加入活性炭粉末后进行脱色,抽滤并收集滤液,用10%的柠檬酸溶液调节滤液的pH,再向其中加入一定比例的乙酸乙酯与水进行萃取,取上层油酯层并使用旋转蒸发器回收乙酸乙酯,干燥,得茶多酚粗品。1.2.2乙醇冲洗次数将聚酰胺置于乙醇中搅拌,并进行24h的浸泡处理,过滤后,滤饼每次使用20mL的乙醇冲洗3次(乙醇可回收并重复使用)。将处理好的聚酰胺倒入层析柱中,使聚酰胺自然沉降,放出柱内多余的乙醇溶液,使液面略高于聚酰胺颗粒表面后关闭活塞,再分别用浓度为5%的NaOH溶液、10%的醋酸溶液洗涤,最后用蒸馏水冲洗至流出液pH为7。1.2.32分离和收集ecgg2结果与讨论2.1产品结构的性能2.1.1旋转光的测量2.1.2苯环骨架c-o-c振动吸收峰如图1所示,提取物的红外光谱在1680cm-1处有一组较强的C-O伸缩振动吸收峰,在1200~1240cm-1处有一组较强的C-O-C非对称伸缩振动吸收峰,在1450~1620cm-1处有苯环骨架特征振动吸收峰,与文献报道一致。2.1.3其他儿茶素合成产物的吸附能力(-)-EGCG的分子构型见图2。(-)-EGCG是α-连苯酚基苯并吡喃与没食子酸形成的酯,其分子结构中有8个酚羟基。在通过聚酰胺柱层析时,分子的吸附能力与酚羟基的数目有关,数目越多,吸附力越强;同时,分子内芳香化程度越高,共轭双键越多,则吸附力越强。所以,与其他儿茶素中成分相比极性较强,(-)-EGCG与聚酰胺分子间的吸附力很强。通过(-)-EGCG的这一特殊性质,可以利用聚酰胺柱层析法对其进行纯化。2.2影响--ecgg脱色效果的因素通过使用紫外光谱对用活性炭脱色后的溶液吸光度的测量,同时参考(-)-EGCG的产率及纯度,分析影响(-)-EGCG脱色效果的因素,进行正交实验,实验因素水平见表1,结果见表2。由表2可知,A、B、C三因素对脱色效果影响的显著性依次为B>A>C,其理论最优水平则为A4B4C4,在此条件下溶液的吸光度为0.0142。2.2.1定量时测定的实验结果随着活性炭加入量增加,脱色效果逐渐增强,但当加入的活性炭达到一定量时,实验结果变化较小。使用过量的活性炭会对溶液中(-)-EGCG产生吸附作用,致使目标产物(-)-EGCG的产量下降。经多次实验发现,当活性炭处于水平3时,脱色与产出的综合效果最好。2.2.2度：2.《生活》卷2《科技传在对样品分别进行多次脱色后发现,经两次脱色后的溶液吸光度基本不变。而脱色次数过多会造成活性炭的浪费,同时在过滤分离的过程中产生(-)-EGCG的损耗,直接导致目标产品产量的降低。故脱色次数处于水平2时,达到的脱色效果最佳。2.2.3活性炭吸附法--ecgg随着时间的增加,脱色效果显著增强,但当脱色时间达到30min后,则脱色液中叶绿素含量吸收度变化不大。当脱色时间过长,会导致(-)-EGCG被活性炭吸附,从而使(-)-EGCG产量下降。综上所述,增大活性炭用量、增加脱色次数或延长脱色时间都会增加活性炭对产物的吸附,使产量下降;但减少活性炭用量、脱色次数及脱色时间则会导致茶多酚粗品的脱色不彻底,从而使实验终产物(-)-EGCG的纯度不高。故实际所选取的最佳水平为A3B2C3,即分两次对溶液进行脱色,每次加入1.3g活性炭粉末,脱色时间为30min,此条件下脱色后溶液的吸光度为0.0149。2.3ph对提取效果的影响乙酸乙酯萃取前用柠檬酸调节滤液,使反应液达到不同pH。实验结束后收集(-)-EGCG并精确称量其产量,结果见图3。从图3中可以看出,随着pH的增加,提取效果增强,(-)-EGCG的产量增加,当pH为4.0时,每10g茶叶中(-)-EGCG的产量达到最大值,约为0.39g;而当pH>4时,随着pH的增加,提取效果逐渐变差。在调节pH时,应控制在4.0左右,这样有利于(-)-EGCG的分离。茶叶中含有包含咖啡碱在内的各种碱性物质,通过调节pH来中和溶液中的碱性物质,但当pH过低即溶液酸度过大时,会使目标产物(-)-EGCG分子中的酯键发生水解反应,从而降低(-)-EGCG的产量。2.4乙酸乙酯的比例对萃取过程的影响在萃取剂中水的体积不变并与溶液中乙醇的体积相同的情况下,将水与乙酸乙酯按不同比例配制后萃取反应溶液。待静置分层后取上层酯相,并用0.45μm的滤膜过滤,经HPLC检测,所得数据如表3。在萃取过程中,溶液中的乙醇与萃取剂中的水、乙酸乙酯分别能够完全互溶,而水与乙酸乙酯则存在部分互溶现象。随着三组分比例不同,平衡时两液相的组成也相应发生变化。在溶液中乙醇体积不变的情况下,随着乙酸乙酯所占比例的增加,乙醇中的(-)-EGCG逐渐向溶解度较大的乙酸乙酯中移动,从而达到萃取浓缩的目的;但当乙酸乙酯比例进一步增加时,体系中的水也同时开始与乙酸乙酯互溶,两液相组成越来越接近,甚至在某一点时可以形成同一液相,从而对后面的分离过程造成困难。由实验结果可知,当水与乙酸乙酯的配比为1∶3时,萃取的效果最好。2.5酯相的hplc---乙酸酯相的检测乙醇和水的混合液的流动相中,分别取乙醇所占的体积比为50%、60%、70%、80%、90%、100%进行分离。六次所得酯相均经HPLC检测,以体积比为横坐标,以(-)-EGCG的峰高与表儿茶素(EC)峰高的比值为纵坐标作图。由图可得,乙醇的体积比为90%时的分离效果最好。3--ecgg的制备3.1每10g茶叶使用总量为2.6g的活性炭,分两次进行脱色,每次脱色时间为30min,所得茶多酚粗品的脱色效果最好。3.2脱色后溶液的pH、水与乙酸乙酯的配比及洗脱剂中乙醇的浓度对(-)-EGCG产量及纯度有明显影响,当萃取液的pH为4.0,水与乙酸乙酯的配比为1∶3,流动相中乙醇含量为90%时所得结果最好。将所得的茶多酚粗品加适量蒸馏水溶解后上聚酰胺柱。先用100mL蒸馏水