分子间力对大豆蛋白凝胶形成及质构特性的影响

分子间力对大豆蛋白凝胶形成及质构特性的影响

大豆及其产品是中国的重要传统食品。它有着悠久的历史、高昂的营养价值和广阔的发展前景。例如豆腐中含有人体所需的8种必需氨基酸，且具有高蛋白、低胆固醇的营养特点，经常食用豆腐，可以降低血液中胆固醇的含量，减少动脉硬化的机会，同时对神经衰弱和体质虚弱的人有很大的利益，对高血压、冠心病等患者在治疗过程中也有一定的辅助疗效作用。以豆腐和豆腐干为代表的豆制品不仅具有较高的营养价值，其中的大豆蛋白还有许多优良的加工特性，凝胶特性就是大豆蛋白最为主要的功能特性之一。无论形成哪种凝胶，蛋白质分子间的作用力无外乎以下几种：一是共价键交联，包括形成新的肽键和肽链间的二硫键；二是离子键，即肽链分子间正负电荷的吸引作用；三是肽链间的次级键作用，包括氢键和疏水作用。这些作用力需要克服肽链分子间的排斥力，如静电斥力和位垒，当这些作用力大于斥力时才能形成凝胶，否则不能。使用不同的凝固剂形成的大豆蛋白凝胶分子间作用不同，目前主要用间接手段研究蛋白质凝胶过程中分子间的作用力。利用可以增强或削弱蛋白质分子间作用力的试剂观察凝胶特性的变化，如利用添加强的表面活性剂十二烷基磺酸钠(SDS)可以破坏疏水作用，氯化钠等高溶解度的盐类可以破坏蛋白质分子间的静电引力。至今，已有较多研究报道了大豆蛋白的热促凝胶能力以及一些环境因素对其凝胶能力或凝胶过程的影响。李里特等研究在豆腐加工过程中对豆腐凝胶形成起重要作用的几个影响因素，研究发现豆浆的加热条件、凝固条件和凝固剂的浓度对豆腐凝胶强度起到直接的作用。王飞镝等研究以大豆蛋白为原料制备的水凝胶、CaCl2凝胶和乙醇凝胶的流变学性质与吸水性。吴晖等通过动态振荡测量考察了NaCl和CaCl2对商用大豆分离蛋白(SPI)热诱导凝胶的胶凝过程及动态黏弹性的影响。然而，大多此类报道都是分别研究热诱导胶凝和盐诱导胶凝，而实际生产中，往往涉及几种诱导因素的综合应用，例如在豆腐、豆腐干等大豆食品的生产中涉及到加热和加盐两种诱导因素，关于这方面的报道比较少。本实验主要讨论分子间作用力对多因素诱导的大豆蛋白凝胶体系的影响情况，以期对建立多因素诱导凝胶体系模型、加强传统豆制品基础研究以及大豆制品深加工和大规模的工业化生产产生重要影响。1材料和方法1.1分离蛋白有限公司大豆分离蛋白(SPI)山东禹王大豆分离蛋白有限公司；石膏(食品级)市售；氢氧化钠、盐酸、十二烷基磺酸钠(SDS)、脲、氯化钠均为分析纯。1.2电子酸度计和多利斯科学仪器恒温水浴锅；PF-101集热式恒温加热磁力搅拌器郑州长城科工贸有限公司；电子酸度计美国热电公司；电子天平(e=10d)赛多利斯科学仪器有限公司；TA.XT.plus质构仪TextureAnalyser英国公司；NDJ-9S数显黏度计上海精密科学仪器有限公司。1.3方法1.3.1凝胶的形成温度影响SPI凝胶形成的因素主要包括SPI质量分数、pH值、石膏用量，点浆温度以及凝胶形成温度等。通过单因素试验，平行对比确定蛋白凝胶形成的适宜条件为：SPI质量分数12%，pH7.5，石膏用量8%，点浆温度以及凝胶形成温度均为80℃。1.3.2石膏黏度的测定分别准确称取3gSPI，溶解于25ml的蒸馏水中，并进行标记。用2mol/LNaOH溶液和1mol/L盐酸溶液调至pH7.5。搅拌均匀后，在电炉上加热至沸腾后不停搅拌，煮沸2.5min后取下，将称好的石膏加入5ml的蒸馏水搅拌均匀。待SPI溶液冷却至80℃时，加入石膏溶液(终浓度为8%)，边加边搅拌，加入后不停的搅拌1min，最后杯口封上保鲜膜，放入到80℃恒温水浴锅中，计时。每隔20min取出样品，用黏度计测其黏度。其中转子型号：S-4#，转速：12r/min。1.3.3在石膏硬化和spi过程中，分子间的静电作用1.3.3.1.nacl对spi凝胶形成的影响根据1.3.1节中方法，加入不同浓度的NaCl溶液制备SPI凝胶，记录凝胶形成情况。1.3.3.2.不同ph值对凝胶形成的影响根据1.3.1节中方法，将溶液pH值调至不同范围，分别制备SPI凝胶，记录凝胶形成情况。1.3.4质构特性根据1.3.1节中方法，分别加入不同浓度的SDS溶液，制备SPI凝胶，记录凝胶形成情况并分别测定其质构特性。TPA测定条件为：测定模式和选项TPA；测定前探头速度2.00mm/s；测定时探头速度2.00mm/s；测定后探头速度2.00mm/s；测定距离为凝胶厚度的30%；探头两次测定间隔时间3.00s；触发类型为自动；触发力5.0g；探头型号P/6(直径6mm)；数据攫取速率50.00pps。1.3.5不同浓度对spi凝胶质构特性的影响根据1.3.1节中方法，分别加入不同量的脲，使溶液中脲的终浓度分别为0、0.2、0.4、0.6mol/L，制备SPI凝胶，记录凝胶形成情况并测定其质构特性。TPA测定条件同1.3.4节。2结果与分析2.1凝胶的形成时间由图1可以看出，在0～60min的过程中，随着凝胶形成时间的不断延长，SPI溶液的黏度缓慢增大；在60～100min的过程中，随着凝胶形成时间的不断延长，黏度明显增大；在100～120min的过程中，随着凝胶形成时间的不断延长，黏度值逐渐趋于平缓并保持不变。黏性是分子运动和分子间引力的体现，黏度的变化说明SPI在石膏的作用下分子间引力增加，导致体系分子间的内摩擦力增加即黏度上升。黏度在接近凝固点时的变化明显，说明存在分子结构的变化或分子间作用力的增加。2.2在石膏硬化和spi过程中，分子间的静电作用2.2.1nacl对肽链表面负电荷的影响如图2所示，当NaCl浓度在0～0.05mol/L范围时，凝胶形成时间随着NaCl浓度的增大而缩短，当NaCl浓度超过0.05mol/L时，凝胶形成时间延长。大豆7S球蛋白的等电点是4.6，大豆11S球蛋白的等电点大约为5.0，因此，SPI带净的负电荷。大豆蛋白质变性后，展开的肽链含有带电荷的基团，同性电荷基团的产生静电斥力阻碍肽链之间的相互结合，NaCl在低浓度时具有中和SPI表面负电荷，降低肽链间静电斥力的作用，使得SPI分子间的静电排斥力小于静电吸引力，有利于肽链之间相互接近和凝聚，缩短凝胶形成时间。因此，NaCl的加入有利于中和大豆蛋白表面的负电荷，降低肽链间的静电斥力，有利于肽链间相互接近和凝聚。凝固时间缩短，同时凝固强度增加。NaCl可以使蛋白质水化作用增强，从而破坏蛋白质分子间的次级键，因此，继续增加NaCl的浓度时，蛋白质的水化作用逐渐加强，使蛋白质有向水中“溶解”的趋势，这种趋势又阻碍了蛋白质分子间的凝聚，不利于凝胶的形成，使凝胶强度下降，凝固时间增加。这就说明离子键在热凝胶和无机盐凝胶的形成过程中起非常重要的作用，这与Kohyama等的报道一致。2.2.2ph值对豆腐凝胶的影响实验过程中发现，pH值小于7.0时，产生沉淀现象，凝胶无法形成；而pH7.0～9.0时，凝胶形成时间随着pH值的增大而缩短。本实验中，SPI受热变性，肽链展开。当pH值处于等电点时，SPI分子不带电荷，分子之间的作用力大于与水的作用力，相互聚集沉淀；当pH值远离等电点时，SPI分子带有同种电荷，相互排斥力占主导，当静电排斥力与蛋白分子变性后暴露的疏水基团之间的吸引力达到平衡时，凝胶形成。随着pH值的增大，游离水量越少，形成的豆腐凝胶情况越好，但pH值过大会导致蛋白质分子变性。结合NaCl对石膏凝固SPI的影响，可以得到这样的结论：在石膏凝固SPI过程中离子键的作用较大，凝胶凝固过程需要克服蛋白质分子间的静电斥力。2.3sds对凝胶保水性和硬度的影响如图3所示，当SDS质量分数在0～0.5%时，随着SDS的增加，SPI凝胶形成的时间明显缩短，说明SDS有加速凝胶形成的作用。SDS是一种强的亲水表面活性剂，这样加入SDS后，可以破坏蛋白质分子的疏水结合，有助于肽链的充分展开，疏水基团的暴露，蛋白溶液的疏水性增大，有利于凝胶网络的形成，凝胶形成时间缩短。另外溶液的疏水性的增大，有利于链间二硫键的形成，从而有助于凝胶结构的稳定。由表1可知，随着SDS质量分数的增加，形成凝胶的硬度显著提高，并且呈现明显的梯度。凝胶的弹性出现峰值，先增加后减小，SDS质量分数再增加，变化不大。黏附性产生较大波动，但还未发现其规律，有待进一步研究。SDS对内聚性的影响不明显。凝胶硬度增大，而凝胶弹性降低，说明SDS的添加可以使凝胶网络结构更加牢固，分子间作用力增强。凝胶硬度反映了蛋白分子间相互作用的强弱和分子间的成键数目的多少，而凝胶弹性是对凝胶结构在第一次下压后破坏程度的反映。煮沸时，蛋白质变性，空间结构被破坏，肽链伸展，使疏水氨基酸残基和疏水氨基酸侧链暴露出来，肽链疏水性增加，使蛋白质分子相互靠近，疏水基团一致向内聚集。SDS是一种强的亲水表面活性剂，可以降低溶液表面张力。本实验的结果显示当加入SDS时，凝胶形成时间缩短，推断可能是因为在SDS作用下，蛋白质分子迅速排列成有序状，形成凝胶结构。通过以上分析，可以得到这样的结论：疏水作用对SPI形成凝胶是非常重要的作用力。2.4不同浓度哌对肽链间氢键形成的影响如图4显示，当脲浓度在0～0.6mol/L时，随着脲浓度的不断增大，凝胶形成时间逐渐延长，当脲浓度增大到0.6mol/L时，凝胶基本无法形成。大豆蛋白变性前肽链之间主要靠链间形成的氢键和肽链表面与水形成的氢键维持稳定，另外，多肽主链上的羰基氧和酰氨氢之间、侧链与侧链、侧链与介质水、主链肽基与侧链或主链肽基与水之间都可以形成氢键，煮沸后蛋白质变性，肽链展开随机排列，破坏了原来的氢键，原来形成氢键的基团暴露，暴露的氢键基团促进展开的肽链相互聚集，氢键的结合使得肽链形成稳定结构。当加入一定浓度的脲后，脲与肽链间的氢键基团结合，肽链上的氢键基团被屏蔽，影响肽链间氢键的形成。这就表明随着脲浓度的增大，脲对肽链间氢键形成的影响加大，从而导致凝胶形成时间的延长。由此可以看出氢键是大豆蛋白凝胶形成的分子间作用力之一，对大豆蛋白凝胶的形成有重要的影响。凝胶硬度主要反应的是形成凝胶结构的肽链间成键数的多少，肽链间成键数越多，硬度越大。本实验中，随着脲浓度的增加，凝胶的硬度减小，并且呈现明显的梯度变化，这说明，脲使氢键发生破坏。脲使凝胶弹性略有增加，但并不随浓度增加而变化。脲使凝胶黏附性减小，内聚性增加。结合脲对石膏凝固SPI凝固时间的影响进行分析，氢键对SPI凝胶形成是非常重要的。3凝胶的形成过程大豆蛋白凝胶网络的形成是蛋白质分子与蛋白质分子、蛋白质分子与水分子之间相互吸引与推持平衡的结果，这一过程主要是将蛋白肽链的疏水区域和巯基暴露，为豆腐凝胶的形成打下基础。将生豆浆进行热处理使大豆蛋白质发生热变性是豆腐凝胶形成的必要条件之一。前人曾经提出SPI在最初加热阶段首先形成可溶性凝聚，继续加热，此可溶性凝聚相互缔合形成宏观聚集体，最后形成内部结构排列有序的凝胶空间网络。大豆蛋白凝胶的形成主要依靠分子间的氢键、离子键、二硫键和疏水作用。其中疏水相互作用和氢键对大豆球蛋白凝胶的形成非常重要。本研究采用SPI模拟豆腐复合体系中凝胶形成的过程，探讨分子间作用力对多因素诱导的大豆蛋白凝胶体系的影响情况，通过观察认为整个凝胶形成过程是肽链首先聚集形成一个胶核，然后展开的肽链逐渐依附，肽链分子有序连接，最终形成凝胶三