响应面法优化反胶束法萃取葵花蛋白工艺

响应面法优化反胶束法萃取葵花蛋白工艺

奎花籽是世界上第二大的油提炼物，含有20%30%的蛋白质，必要氨基酸含量高。这是富含营养化学资源和蛋白质的资源。反胶束法萃取蛋白质主要包括2个步骤:前萃取和后萃取。所谓前萃取是指在宏观两相(有机相和水相)界面间的表面活性剂层同邻近的蛋白质发生静电作用而变形,接着在两相界面形成了包含有生物活性物的反胶束,此反胶束扩散进入有机相,从而实现蛋白质的萃取分离;所谓后萃取即将反胶束溶液和KCl溶液接触,调节溶液的pH值和离子强度等因素,使蛋白质转入水相[3～6]。本文主要研究了在反胶束法后萃取脱脂葵花蛋白的过程中,各种工艺参数对后萃取过程的影响,并且在单因素试验的基础上,通过响应面分析确定了反胶束法后萃取脱脂葵花蛋白的最佳工艺条件。反胶束法具有良好的工业应用前景,可提高葵花蛋白资源的利用率。1试验材料和方法1.1化学试剂的制备脱脂葵花粕,试验室自制。二辛基琥珀酸磺酸钠(AOT)为试验试剂;异辛烷、氯化钾、氢氧化钠、硼酸、浓硫酸、碳酸氢钠、柠檬酸、盐酸、磷酸氢二钠和氯化钠等均为国产分析纯,购于国药集团化学试剂有限公司。DF-Ⅱ集热式磁力加热搅拌器、TDL-5-A台式离心机、电热恒温鼓风干燥箱和PHS-3C精密pH计。1.2测试方法1.2.1反胶束法前萃取脂牡丹花粕蛋白准确称取一定量的脱脂葵花粕粉加入到反胶束溶液中,用磁力搅拌器37℃搅拌1h,然后5000r/min离心20min,取上清液(即为前萃液),测量体积,取5mL萃取液消化,最后定氮,计算反胶束法前萃取脱脂葵花粕蛋白含量。1.2.2kcl缓冲溶液的制备将前萃液加入到等体积的具有一定pH值(8.5、9.0、9.5、10.0和10.5)和离子强度(0.50、0.75、1.00、1.25和1.50mol/L)的KCl缓冲溶液,在磁力搅拌器上搅拌一定时间(20、30、40、50和60min),萃取温度均为40℃。然后将上述溶液置于分液漏斗中,静置,使其分层,取下层水相(蛋白质中残留部分AOT)5mL进行消化,用微量的凯式定氮法分析其蛋白质含量,计算蛋白质后萃取率。蛋白质后萃取率按如下公式计算:1.2.3单次萃取时间和萃取效率(1)KCl浓度对脱脂葵花蛋白后萃取率的影响。分别量取50mL萃取液置于5个干净的250mL烧杯中,再向其中加入KCl浓度分别为0.50、0.75、1.00、1.25和1.50mol/L,pH值10.0的KCl缓冲溶液50mL,萃取温度为40℃。在磁力搅拌器上搅拌50min。之后倒入分液漏斗中,分层后取下层液体(含蛋白质),从中取5mL进行消化,最后用凯式定氮法测出蛋白质含量,计算后萃取率。(2)pH值对脱脂葵花蛋白后萃取率的影响。分别量取50mL萃取液置于5个干净的250mL烧杯中,再向其中各加入用1.0mol/L的KCl,pH值分别为8.5、9.0、9.5、10.0和10.5的KCl缓冲溶液各50mL,萃取温度为40℃。在磁力搅拌器上搅拌50min。之后倒入分液漏斗中,分层后取下层液体(含蛋白质),从中取5mL进行消化,最后用凯式定氮法测出蛋白质含量,计算后萃取率。(3)萃取时间对脱脂葵花蛋白后萃取率的影响。分别量取50mL萃取液置于5个干净的250mL烧杯中,再向其中各加入50mLKCl浓度为1.0mol/L,pH值10.0的KCl缓冲溶液,萃取温度为40℃。在磁力搅拌器上分别搅拌20、30、40、50和60min。之后倒入分液漏斗中,分层后取下层液体(含蛋白质),从中取5mL进行消化,最后用凯式定氮法测出蛋白质含量,计算后萃取率。1.2.4响应面优化试验采用Box-Behnken试验设计方案,以萃取时间、缓冲液pH值和KCl浓度3个因素为自变量,以脱脂葵花蛋白后萃取率为响应值,设计三因素三水平的响应面分析试验。2结果与分析2.1盐浓度对膜分离、萃取率的影响由图1可知:当KCl浓度从0.50mol/L增加到1.25mol/L时,蛋白后萃取率显著增加,再继续增加KCl浓度,蛋白后萃取率呈现下降的趋势,这是因为离子强度增加时,在胶束内部产生静电屏蔽作用,使蛋白质分子与AOT分子之间的静电作用减弱,发生解聚,而且,高离子强度产生的屏蔽效应会使表面活性剂极性头之间的斥力减弱,水核半径减小,这些因素有利于蛋白质分子进入到缓冲溶液中,使蛋白后萃率增加。但是盐浓度过高,脱脂葵花蛋白的后萃率随之下降,其可能原因是当离子浓度过大时,盐对蛋白质的盐析作用也增强,造成蛋白质的提取率下降。所以在响应面分析中,本研究选择KCl浓度1.25mol/L作为中心点。2.2ph值对蛋白萃取效率的影响由图2可知:KCl缓冲液pH值从8.5变化到9.5时,蛋白后萃取率显著增加,这符合蛋白质在水中的溶解特性,主要是因为蛋白质的后萃率与蛋白质在水溶液中的溶解度有非常大的关系。而当pH值从9.5增加到10.5时,蛋白后萃率又显著降低,这可能是由于随着pH值继续增加,蛋白质带负电荷数量增加,使蛋白质和反胶束的疏水作用增强,不利于蛋白质从反胶束溶液进入水相,因此蛋白质后萃率降低。通过本试验可知,在反胶束法提取脱脂葵花蛋白的后萃取过程中,与AOT结合的脱脂葵花蛋白在缓冲溶液中的最佳溶解pH值是9.5。2.3萃取时间的影响由图3可知:随着萃取时间的增加,脱脂葵花籽蛋白后萃取率在20～40min急剧上升,50min时达到最大值,到60min左右基本保持平衡,原因是随着萃取时间的延长,蛋白分子逐渐转入缓冲溶液中,使蛋白后萃取率增加。由图说明50min为反胶束法后萃取脱脂葵花蛋白的最适合的提取时间。2.4反胶束萃取条件的优化在单因素试验基础上,固定萃取温度40℃,选择萃取时间、缓冲液的pH值和KCl浓度3个因素为自变量,采用中心组合设计对反胶束法后萃取脱脂葵花蛋白的工艺条件做进一步优化。2.4.1模型方差分析Box-Behnken试验设计方案及相应的响应值在表1中给出。由SAS对表1中的试验数据进行回归拟合,获得二次多项回归方程为:由表2的回归方程的方差分析可知:模型p=0.0209<0.05,表明模型方程显著,即不同萃取条件对脱脂葵花蛋白后萃取率影响显著;整个模型的R2为0.9289,变异系数为9.1370,说明模型的拟合度很好,可以准确地反应自变量之间的关系。由表2的回归方程的各项系数显著性检验可知:一次项(p<0.05)、二次项(p<0.05)对脱脂葵花蛋白后萃取率影响显著,而交互相作用不显著(p>0.05)。2.4.2回归方程的稳定性由响应曲面分析可知:X1(KCl浓度)对响应值的影响最大,其次为X2(pH值),而X3(萃取时间)对响应值的影响较小。另外,回归方程存在稳定点,稳定点是极大值点,通过岭嵴分析(ridgeanalysis)得到极大值。所对应的各主要因素(X1、X2、X3)的编码值分别为(0.404560、-0.027136、0.011218),即最佳条件是:KCl浓度1.35mol/L、缓冲液pH值9.49和萃取时间50min,此时脱脂葵花蛋白后萃率达到52.54%,与模型的预测值(53.17%)基本相符。3能耗低,易操作利用反胶束的方法从脱脂葵花粕中萃取蛋白质是可行的,与传统的葵花蛋白提取方法——盐溶碱提酸沉法