中药指纹图谱和特征图谱研究及其标准建立

中药指纹图谱和特征图谱研究

及其标准建立第一部分

中药指纹图谱检测标准研究1、建立中药指纹图谱检测标准的必要性一、概述中药药材饮片提取物中成药特点与问题来源于生物，化学成分变化大化学成分复杂，有效成分尚未阐明多成分、多靶点作用种植技术与生产过程控制水平差药品质量一致性生物等效性使用安全性单指标或少数指标定性、定量分析特征图谱鉴别指纹图谱整体成分控制？指纹图谱：中药指纹图谱系指中药包括中药材、饮片、提取物或中成药经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示该中药主要化学成分特性的色谱或光谱的图谱。中药质量评价中常用色谱指纹图谱。特征指纹图谱：系指从中药指纹图谱中选取若干专属性强的色谱峰或色谱峰组合组成特征指纹图谱。主要用于中药的专属性鉴别。特点：特征性：通过指纹图谱的特征性，能有效鉴别样品的真伪或产地；整体性：通过指纹图谱能够体现主要化学成分的特性，整体控制样品的质量。半定量：通过指纹图谱主要色谱峰的面积、比例或相似度的制定，能有效控制样品的质量，确保样品质量的相对一致。2、中药指纹图谱的定义与特点3、中药指纹图谱的作用中药质量标准的组成部分药材栽培、加工技术建立的质量评价企业产品质量的内控标准企业药品生产的过程控制企业产品创优或打假二、中药指纹图谱检测标准的建立中药材、饮片指纹图谱检测标准的建立提取物、中成药指纹图谱检测标准的建立(一)中药材、饮片指纹图谱的建立基原：品种药用部位产地栽培技术产地加工方法炮制供试品溶液的制备方法对照品溶液或参照物溶液的制备方法测定方法、条件的考察方法学考察：稳定性、精密度、重现性对照指纹图谱的建立特征指纹图谱的建立1、基原与药用部位明确基原固定基原明确药用部位东北铁线莲棉团铁线莲威灵仙威灵仙三种基原植物指纹图谱比较掌叶大黄唐古特大黄药用大黄大黄三种基原植物指纹图谱比较2、产地固定产地南疆各地产管花肉苁蓉指纹图谱比较3、栽培技术、加工方法、炮制明确栽培技术固定产地加工方法固定炮制方法酒大黄熟大黄大黄炭4、供试品的制备方法供试品的取样：保证供试品的代表性和均一性。供试品溶液的制备：应根据药材、饮片中所含化学成分的理化性质和检测方法的需要，选择适宜的方法进行制备。制备方法必须确保样品中的主要化学成分在指纹图谱中的体现。考察内容：提取方法、溶剂、时间、温度、次数；纯化方法大黄样品提取方法考察a.超声；b.回流；c.索氏提取5、参照物溶液的制备制定指纹图谱必须设立参照物。应根据供试品中所含成分的性质，选择适宜的对照品作为参照物，如果没有适宜的对照品，可选择适宜的内标物作为参照物。参照物的制备应根据检测方法的需要，选择适宜的方法进行制备。6、测定方法、条件的考察包括测定方法、仪器、试剂、测定条件等。应根据药材、饮片所含化学成分的理化性质，选择适宜的测定方法，建议优先考虑色谱方法。对于成分复杂的药材、饮片，必要时可以考虑采用多种测定方法，建立多张指纹图谱。色谱方法：色谱柱、薄层板、测定条件（进样量、检测方法、流动相、柱温、流速等）应进行考察，建立最佳测定条件。大黄HPLC指纹图谱检测波长的考察大黄HPLC指纹图谱流动相考察

大黄HPLC指纹图谱色谱柱考察(a)WaterSymmetryShieldTMC18column;(b)AichromBond-AQC18column;(c)Kromasil100AC18column;(d)Zorbaxeclipse×DBC18column7、方法学考察稳定性试验：样品溶液配置后在不同时间测定，采用相似度软件评价，其相似度应不低于0.90。样品0h2h4h8h16h24h相关系数中位数）0.99250.98540.99890.99270.98020.9988肉苁蓉HPLC指纹图谱稳定性考察结果7、方法学考察重复性试验：取同一批号的样品6份以上，按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，测定指纹图谱，用相似度软件评价，其相似度应不低于0.90。样品12345相关系数（中位数）0.99760.99940.99340.99540.9969肉苁蓉HPLC指纹图谱重复性考察结果7、方法学考察中间精密度试验：取同一批样品，在不同日期、不同分析人员、不同设备的条件下进行测定，其相似度应不低于0.90。样品12345相关系数(中位数)0.99300.99280.98310.99290.9966肉苁蓉HPLC指纹图谱中间精密度考察结果7、方法学考察重现性试验：不同实验室的复核试验，作为国家标准，一般由药品检验所复核。方法耐用性试验：适当改变色谱条件，如流动相的比例、pH值、不同品牌的色谱柱、柱温、流速、检测波长等，观察指纹图谱的变化状况。8、指纹图谱及技术参数对照指纹图谱的建立指纹图谱的评价(1)对照指纹图谱的建立根据供试品的检测结果，建立对照指纹图谱。采用HPLC和GC制定指纹图谱，其记录时间根据样品所含成分的情况而定；采用TLCS制定指纹图谱，必须提供从原点至溶剂前沿的图谱。化学成分类型复杂的品种，必要时可建立多张指纹图谱。对照指纹图谱的建立：根据10批次以上供试品的检测结果及其相关参数，制定对照指纹图谱。可选择相似度评价软件中生成的共有模式图谱作为对照指纹图谱，也可选择相似度最高的指纹图谱作为对照指纹图谱。共有指纹峰的标定采用色谱方法建立指纹图谱，可采用保留时间或相对保留时间标定色谱峰。根据10批次以上供试品的检测结果，标定共有指纹峰。十三批肉苁蓉样品指纹图谱检测结果12345679810S111213141615171819202122肉苁蓉对照指纹图谱对照指纹图谱的建立2、指纹图谱的评价以指纹图谱相似度评价系统进行评价以相对保留时间和峰面积比值进行评价指纹图谱相似度评价系统评价指纹图谱相似度评价系统评价十三批肉苁蓉样品指纹图谱相似度评价结果共有指纹峰面积的比值以对照品作为参照物的指纹图谱，以参照物峰面积作为1，计算各共有指纹峰面积与参照物峰面积的比值；以内标物作为参照物的指纹图谱，则以共有指纹峰中其中一个峰（要求峰面积相对较大、较稳定的共有峰）的峰面积作为1，计算其他各共有指纹峰面积的比值。根据10批以上样品的测定结果，结合质量标准中其它各项的检测结果，制定合理的比值。8、特征图谱的建立与评价特征图谱的建立：通过不同来源的10批以上样品的测定结果，选择特征峰或数个色谱峰组成的具有特征性的色谱峰组合作为特征图谱。特征图谱的评价：采用保留时间或相对保留时间，必要时结合色谱峰面积的比值进行评价。白鲜碱黄柏酮梣酮不同产地白鲜皮特征图谱白鲜皮药材对照特征图谱白鲜皮根皮与木心部分指纹图谱比较根皮木心

白木香茎木

沉香白木香茎木沉香HPLC色谱图LC-MS总离子流图基于指纹图谱技术的沉香药材及其伪品鉴定不同产地沉香药材指纹图谱分析伪品沉香的指纹图谱分析劣质品沉香样品指纹图谱分析(二)中药提取物、中成药指纹图谱检测标准的建立供试品溶液的制备方法对照品或参照物溶液的制备方法测定方法、条件的考察饮片、中间体、成品的相关性考察方法学考察：稳定性、重复性、中间精密度、重现性、耐用性试验指纹图谱的建立与评价特征图谱的建立与评价中药注射剂指纹图谱的评价以指纹图谱相似度评价软件评价中间体和注射剂指纹图谱的相似度应不低于0.90。以色谱峰面积的比值评价峰面积比值的要求：保留时间小于或等于30分钟的共有峰：

Ai≥20％At：SD≤±20％；

20％At>Ai≥10％At：SD≤±25％；

10％At>Ai≥5％At：SD≤±30％；

Ai<5％At：峰面积比值不作要求，但必须标定相对保留时间。保留时间超过30分钟的共有峰：

Ai≥10％At：按上述规定执行；

Ai<10％At：峰面积比值不作要求，但必须标定相对保留时间。非共有峰面积供试品图谱与指纹图谱比较，非共有峰总面积不得大于总峰面积的5％。中药材、提取物、中间体和中成药指纹图谱之间的相关性

为了确保制备工艺的科学性和稳定性，应根据中药材、提取物、中间体和中成药的指纹图谱，标定各图谱之间的相关性。(三)中药指纹图谱检测标准的格式【性状】【鉴别】【检查】【指纹图谱】或【特征图谱】照高效液相色谱法（附件ⅥD）测定。色谱条件与系统适用性试验参照物溶液的制备供试品溶液的制备测定法

指纹图谱：按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，供试品指纹图谱与对照指纹图谱经相似度计算，相似度不得低于0.90。

（附对照指纹图谱）

特征图谱：供试品特征图谱中应呈现？个特征峰，与参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，应在规定值的±5%范围之内。相对保留时间规定为：？（峰1）、？（峰2）、？（峰3）。

（附对照特征图谱）【含量测定】丹参总酚酸提取物（2010版药典一部）【指纹图谱】照高效液相色谱法（附录VID)测定。色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以乙腈为流动相A，以0.05％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为286nm；柱温为30℃；流速为每分钟1.0ml。理论板数按迷迭香酸峰计算应不低于20000。

参照物溶液的制备取迷迭香酸对照品和丹酚酸B对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml各含0.2mg的溶液，即得。供试品溶液的制备取[含量测定]项下的供试品溶液，即得。测定法分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。

按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，供试品指纹图谱与对照指纹图谱经相似度计算，相似度不得低于0.90。时间（分钟）流动相A(%)流动相B(%)0～1515～3535～4545～5555～7010→2020→2525→3030→909090→8080→7575→7070→10108个共有峰中峰2：原儿茶醛峰5：迷迭香酸峰6：紫草素峰7：丹酚酸B【特征图谱】照高效液相色谱法（附录VID)测定。色谱条件与系统适用性试验

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以四氢呋喃-甲醇-乙腈-乙酸-水(38：3：3：4：152)为流动相；检测波长为330nm。理论板数按牡荆素鼠李糖苷峰计算应不低于2500。参照物溶液的制备

取牡荆素鼠李糖苷对照品适量，精密称定，加60％乙醇制成每1ml含100μg的溶液，即得。供试品溶液的制备

取本品50mg，精密称定，置50ml量瓶中，加60％乙醇溶解并稀释至刻度，即得。峰1：牡荆素葡萄糖苷峰S：牡荆素鼠李糖苷峰2：牡荆素峰3：金丝桃苷测定法

分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。供试品特征图谱中应呈现4个特征峰，与参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，应在规定值的±5％范围之内。相对保留时间规定值为：0.76(峰1)、1.00(峰S)、1.55(峰2)、1.94(峰3)。山楂叶提取物特征图谱（2010版药典一部）第二部分

指纹图谱深层次研究与扩展应用一、指纹图谱深层次研究指纹图谱色谱峰的鉴定LC-DAD-MSn指纹图谱分析与中药化学成分信息库的构建NMR指纹图谱研究1、指纹图谱色谱峰的鉴定

唐古特大黄指纹图谱主要色谱峰的鉴定对照品对照

NoIdentificationRt(min)RRtPARPAλmax(nm)1Chrysophanol129.961.17164.70.383225,2602Aloe-emodin108.960.98128.60.169225,2603Physcion137.921.24226.60.155225,2654Rhein111.821.00782.20.486230,2605Emodin119.071.07241.50.245225,2656Chrysophanol-8-O-β-D-glucopyranoside91.350.82380.90.478225,2607Aloe-emodin-8-O-β-D-glucopyranoside38.940.351305.01.804225,2608Trans-3,5,4´-trihydroxystilbene69.950.63016.20.0963009Trans-3,5,4´-trihydroxystilbene-4´-O-β-D-glucopyranoside25.860.233127.00.751215,31010(-)-Epicatechin-3-O-gallate35.890.323128.50.76027511(+)-Catechin15.360.138202.21.196210,27512Lindleyin46.360.417100.60.594220,27513Isolindleyin41.530.374100.20.593220,275144-(4-hydroxyphenyl)-2-butanone-4´-O-β-D-(6´´-O-galloyl-2´´-O-cinnamoyl)-glucopyranoside111.031169.11218,275154-(4-hydroxyphenyl)-2-butanone-4´-O-β-D-(2´´-O-galloyl-6´´-O-p-coumaroyl)-glucopyranoside98.490.88799.00.585225,30016Torachryssone-8-O-β-D-glucopyranoside89.060.802104.30.618220,26017Trans-3,5,4´-trihydroxystilbene-4´-O-β-D-(2´´-O-galloyl)-glucopyranoside51.650.46554.10.320220,30018Trans-3,5,4´-trihydroxystilbene-4´-O-β-D-(6´´-O-galloyl)-glucopyranoside54.440.490267.21.580220,30019SennosideA67.970.61253.80.318270,35020SennosideB47.600.428130.077270,360唐古特大黄指纹图谱中20个色谱峰的鉴定结果

唐古特大黄的HPLC/MS/MS分析唐古特大黄LC-MS对照指纹图谱

色谱条件与系统适用性试验

流动相以乙酸代替磷酸，其它同HPLC指纹图谱。MicromassQ-ToFMicroTM质谱仪，负离子模式，一级MS碰撞电压10V，二级MS碰撞电压30V。

RAPIDCOMMUNICATIONSINMASSSPECTROMETRY,2007;21:2351-23602、LC-DAD-MSn指纹图谱分析与中药化学成分信息库的构建唐古特大黄LC/MS/MS分析结果

唐古特大黄41个色谱峰的UV和MS2特征

唐古特大黄LC-DAD-MSn化学成分信息数据库的建立活性研究或文献报道中药厚朴的NMR指纹图谱研究中药提取代谢物指纹图谱分析（1HNMR）数据预处理（基线和相校正、保留时间或化学位移漂移校正、归一化等）

相似度比较、多元统计分析（PCA/HCA/PLS-DA）等区分性主成分相关信号的判断（投影图、VIP、STOCSY分析等）标记物的结构鉴定定性、定量分析中药质量控制2DNMRMS/MS指标性成分7654321H2OCHD2ODH+MH+MHMFA6FA4FA3FA7FA2FA1FA5HMHMH80厚朴药材的1HNMR图谱HCA热图分析结果1HNMR和HPLC相关网络分析结果7654321FA2FA3FA5FA4FA6FA7H2OCHD2ODFA180(二)指纹图谱的扩展应用中药材、饮片生产中的应用提取物、中成药生产工艺优化与过程控制中的应用质量标准提高与标准修订中的应用知识产权保护中的应用药效物质的阐明—谱效学研究中药复杂体系药代动力学研究中应用1、指纹图谱在中药材、饮片生产中的应用优良品种选育产地适宜性评价生长年限、采收时间的确定产地加工方法的选择饮片炮制工艺的选择与工艺参数优化于田县达里雅布依乡

于田县奥依托拉克乡

南疆各地产管花肉苁蓉指纹图谱比较

适宜种植区非适宜种植区南疆地区管花肉苁蓉适宜栽培地区不同海拔高度唐古特大黄药材指纹图谱相似度比较ThecomparisonsofRheumtanguticumsofdifferentheights

不同采收季节唐古特大黄药材指纹图谱相似度比较ThecomparisonsofRheumtanguticumsofdifferentharvestingtime

2、指