鸡传染性法氏囊炎活疫苗的制备

鸡传染性法氏囊炎活疫苗的制备

根据《中华人民共和国动物饲料制备和测试条例》（2000年版），鸡泽兴综合征（b87）的活血苗由鸡采集、试验和测试，并通过鸡饲配方连接各种有毒药物。在规定时间内死亡的胎儿和病鸡囊膜的毛尿囊膜中接种疫苗。规程中接种方法有两种:一是鸡胚绒毛尿囊膜(需做人工气室)接种法,另一种是鸡胚尿囊腔接种法。生产实践表明,这两种方法都有它的不足之处:鸡胚绒毛尿囊膜接种法需要做人工气室,其工艺烦琐不易掌握,不适合大批量生产,而且由于做人工气室造成的早死弃胚多(物理性死亡),使成本提高,故大多数生产厂家只有测毒时才会采用,大批量生产已不再使用该方法,而采用鸡胚尿囊腔接种法;尽管尿囊腔接种方法易于操作,但在接种鸡胚后总会有一定比例的存活胚(约10%),即或是采用SPF鸡胚也是如此,由于活胚胎儿病毒含量比死胚胎儿的病毒含量低得多,一般弃掉不用,这样也会使鸡胚的利用率降低。为此,我们借鉴鸡痘活疫苗生产中曾使用过的鸡胚绒毛尿囊膜渗透法来接种鸡胚,结果接种后24h鸡胚早死率略高于尿囊腔接种法,但却大大低于人工气室绒毛尿囊膜接种法,而且没有存活鸡胚,提高了鸡胚利用率,如此弥补了人工气室绒毛尿囊膜接种法和尿囊腔接种法两者的不足。1材料和方法1.1材料表面1.1.1鸡胚绒尿囊膜接种成生产种毒鸡传染性法氏囊B87株冻干种毒,由中国兽医药品监察所提供,经鸡胚绒毛尿囊膜接种,收获感染鸡胚的胎儿和绒毛尿囊膜制备成生产种毒。其病毒含量(ELD50/0.2mL)达107.5以上。1.1.2f鸡SPF鸡胚由山东济南赛斯(SAIS)家禽科技有限公司提供SPF种蛋,自行孵化至10～11日龄的鸡胚。1.1.3生理盐水和冷冻保护剂0.85%生理盐水和含5%蔗糖及含10%脱脂奶的冻干保护剂,经高压灭菌。2～8℃保存备用。1.1.4浓度抗生素溶液配制每mL含10万单位的青、链霉素浓缩液,经滤过除菌,无菌检验阴性,冷冻保存备用。1.1.5组织压力机采用法国进口或国产的组织捣碎机,经包装高压灭菌或以消毒酒精浸泡消毒后备用。1.2方法1.2.1材料的渗透试验首先将生产种毒稀释100倍,然后将鸡胚分为三组:第一组,正常生产组,仍采用鸡胚尿囊腔接种法,每胚0.1mL;第二组,人工气室绒毛尿囊膜接种法,每胚接种0.2mL;第三组,试验组,采用绒毛尿囊膜渗透法,每胚接种0.2mL。具体方法如下:在照蛋器帮助下,避开鸡胚大血管(胎儿正面),划出气室的界限。靠近气室界线处1cm左右划出接种点,涂碘脱碘后,打孔,取带5号半针头的1mL注射器抽取稀释好的种毒液,顺针孔垂直刺入鸡胚尿囊腔中(刺破壳膜和绒毛尿囊膜),然后提起注射器使针头悬于气室中,喷洒注射种毒液,毒液直接接触到刺破点,渗透直接接触感染壳膜下的绒毛尿囊膜,最后达到全胚感染。绒毛尿囊膜渗透法接种示意图详见参考文献。1.2.2接种鸡胚、照胚的制备参照《规程》,接种后,人工气室绒毛尿囊膜接种的鸡胚,将人工气室绒毛尿囊面朝上,尿囊腔和绒毛尿囊膜渗透法接种的鸡胚,气室朝上直立放置。继续于36.5～37℃静止孵化。接种后24h第一次照胚,死胚弃掉,此后每隔4～6h照一次胚,死胚随时取出于2～8℃冷却处理。根据死胚数量分批集中解剖,以15个左右为一组收获胎儿置于无菌容器中,作无菌检验后于-20℃保存。1.2.3鸡胚的诱导诱导将3种方法接种后收获的死亡鸡胚胎儿(头部、四肢或全身具有典型充出血病痕)于组织捣碎机中研磨成组织匀浆,然后按规程中要求用无菌生理盐水分别作10倍系列稀释,取10-5～10-84个滴度,经人工气室绒毛尿囊膜接种10～11日龄SPF鸡胚,每胚0.2mL。人工气室面朝上,36.5℃继续静止孵化观察至120h。其间每隔4～8h照蛋一次,死胚于2～8℃存放,记录鸡胚死亡情况,并解剖观察其胎儿和绒毛尿囊膜的病变。最后计算ELD50/0.2mL。1.2.4成品冻干苗的制备根据半成品的病毒含量,将3种不同方法接种收获的死胚胎儿(无菌检验、效价检验合格)经组织捣碎机研磨成组织匀浆,然后,以1∶1的比例加入冻干保护剂并加入适量浓双抗,冻干制备成成品冻干苗。随机抽取样品,参照《规程》用9～11日龄SPF鸡胚检测(ELD50/每羽)。2结果2.13绒尿囊膜渗透法接种鸡胚的性能尿囊腔接种鸡胚早死率为1.5%,不死率为12%;人工气室绒毛尿囊膜接种鸡胚早死率为15%,不死率为0;绒毛尿囊膜渗透法接种鸡胚早死率为3.3%,不死率也为0;所有死亡鸡胚胎儿都有不同程度的头部、四肢乃至全身充出血症状(见表1)。2.2冻干苗的检测3种接种方法收获的死胚胎儿的ELD50/0.2mL的检测结果差异不大,均在12.5左右,符合《规程》规定的标准。成品冻干苗样品检测(ELD50/羽)结果:尿囊腔途径、人工气室绒毛尿囊膜途径和绒毛尿囊腔渗透途径分别为105.3、105.7和105.5/羽。达到了《规程》规定的标准。3鸡胚表面尿囊腔渗透接种法3.1本试验进一步证实鸡传染性法氏囊炎病毒(B87株)是一种嗜膜性很强的病毒,尤其是对鸡胚绒毛尿囊膜接种最为敏感。从接种鸡胚死亡情况及胎儿和绒毛尿囊膜变化都可以说明经两种绒毛尿囊膜接种方法感染的鸡胚,病毒血症产生的时间早而且严重,接种死亡率为百分之百。3.2绒毛尿囊膜渗透法明显优于原有的尿囊腔接种法和人工气室绒毛尿囊膜接种法。绒毛尿囊膜接种鸡胚早死率低于人工气室绒毛尿囊膜接种鸡胚(低11.7个百分点);尽管其早死率比尿囊腔接种法高出1.8个百分点,但由于没有不死鸡胚,最终使鸡胚利用率实际提高9.93个百分点。说明绒毛尿囊膜渗透接种法弥补了尿囊腔和人工气室绒毛尿囊膜这两种接种方法的不足。3.3根据《规程》要求,主要收获感染的鸡胚胎儿(或有病变的绒毛尿囊膜)作为配苗的半成品,如将种毒稀释倍数适当调整,使鸡胚死亡高峰集中在90h左右则最为理想。此时鸡胚较大,但胎儿尚未发育成熟,绒羽毛短而软,胎儿骨骼钙化也未最后完成,但病毒含量高,而且易于研磨,组织碎