项目5：微生物分离纯化技术

食品微生物技术项目：微生物分离与纯化技术目录CONTENTS1微生物生长与控制3菌种保藏2菌种分离、纯化技术重点：微生物生长曲线及特点微生物分离纯化方法难点：微生物生长量测定方法及原理学习目的：了解分离纯化的目的意义；

掌握分离纯化的技能操作。微生物生长与控制1

什么是生长？1、微生物生长定义生物个体物质有规律地、不可逆增加，导致个体体积扩大的生物学过程。生长：生物个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。繁殖：生长是一个逐步发生的量变过程，繁殖是一个产生新的生命个体的质变过程。1、微生物生长定义一个微生物细胞合适的外界条件，吸收营养物质，进行代谢个体的生长原生质的总量（重量、体积、大小）就不断增加如果各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，引起个体数目的增加。群体内各个个体的进一步生长群体的生长1、微生物生长定义微生物生长:在微生物学中提到的“生长”，一般均指群体生长，这一点与研究大生物时有所不同。群体生长=个体生长+个体繁殖个体生长→个体繁殖→群体生长1、微生物生长定义目的：考察单位时间微生物数量或生物量的变化。微生物生长量的测定：个体计数群体重量测定群体生理指标测定2、微生物生长量的测定工具：显微镜、血球计数板方法：利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量，对微生物数量进行直接计数。1、显微镜直接计数法（一）以数量变化进行测定2、微生物生长量的测定显微镜直接计数法该方法特点：快速；结果不准确不能区分死菌与活菌不适于对运动细菌的计数需要相对高的细菌浓度个体小的细菌在显微镜下难以观察2、微生物生长量的测定注意：一个菌落可能是多个细胞一起形成，所以在科研中一般用菌落形成单位（colonyformingunits，

CFU）来表示，而不是直接表示为细胞数。通常用来测定细菌、酵母菌等单细胞微生物的生长情况；还可测定样品中所含微生物个体的数量。2、平板培养计数法（平板菌落计数）（一）以数量变化进行测定2、微生物生长量的测定（一）以数量变化进行测定

平板培养计数法（平板菌落计数）特点：

耗时；结果相对准确；属于活菌计数，有一定的实际指导意义。2、微生物生长量的测定

对平板计数法结果的影响：01020304操作要求：无菌、熟练、准确样品要充分混匀专管专用（每支移液管只能接触一个稀释度的菌液）同一稀释度平行两个或三个2、微生物生长量的测定（二）以生物量为指标测定微生物生长1、重量法以干重直接衡量微生物群体的生物量；通过测定样品中蛋白质、核酸含量，间接推算微生物群体的生物量。测定多细胞及丝状真菌生长情况的有效方法2、微生物生长量的测定2、比浊法（二）以生物量为指标测定微生物生长在一定波长下，测定菌悬液的光密度，以光密度(O.D.)表示菌量。实验测量时应控制在菌浓度与光密度成正比的线性范围内，否则不准确。2、微生物生长量的测定微生物的特点：个体微小肉眼看到的微生物是成千上万个单个微生物组成的群体。微生物接种是群体接种，接种后的生长是微生物群体繁殖生长。对微生物群体生长规律的了解是对其进行研究与利用的基础。2、微生物生长量的测定同步培养技术：

设法使群体中的所有细胞，尽可能都处于同样细胞生长和分裂周期中，然后分析此群体的各种生物化学特征，从而了解单个细胞所产生的变化。同步生长方法：1、环境条件诱导2、物理方法从随机的、不同步细菌群体选择出同步的群体3、微生物生长的控制-同步培养同步培养：使群体中的细胞处于比较一致的，生长发育均处于同一阶段上，即大多数细胞能同时进行生长或分裂的培养方法。以同步培养方法使群体细胞能处于同一生长阶段，并同时进行分裂的生长。同步生长：通过同步培养方法获得的细胞被称为同步细胞或同步培养物。3、微生物生长的控制-同步培养

同步培养物应用：

（1）常被用来研究在单个细胞上难以研究的生理与遗传特性；（2）作为工业发酵的种子，它是一种理想的材料。

机械方法离心方法过滤分离法硝酸纤维素滤膜法环境条件控制技术温度培养基成份控制其他（光照和黑暗交替培养）3、微生物生长的控制-同步培养生长曲线(GrowthCurve)定义细菌接种到定量培养基中，定时取样测定细胞数量，以培养时间为横座标，以菌数为纵座标作图，得到的一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线。均指群体生长3、微生物生长曲线生长曲线(GrowthCurve)一条典型的生长曲线可分为：迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期等四个生长时期。3、微生物生长曲线迟缓期也称延迟期、适应期。在开始一段时间内菌数不立即增加，或增加很少，生长速度接近于零。3、微生物生长曲线分裂迟缓、代谢活跃迟缓期特点：迟缓期出现的原因：调整代谢在生产实践中缩短迟缓期的常用手段：(1)通过遗传学方法改变菌种的遗传特性；(2)利用对数生长期的细胞作为种子；(3)尽量使接种前后所用培养基组成不要相差太大；(4)适当扩大接种量。3、微生物生长曲线生长曲线(GrowthCurve)以最大的速率生长和分裂，细菌内各成分按比例有规律地增加，数量呈对数增加。对数期3、微生物生长曲线在细菌个体生长里，每个细菌分裂繁殖一代所需的时间为代时(Generationtime)，代时通常以G表示。在群体生长里细菌数量增加一倍所需的时间称为倍增时间（Doublingtime)。对数期有关概念：影响代时的原因：

菌种；营养成分；营养物浓度；温度。3、微生物生长曲线生长曲线(GrowthCurve)定义稳定生长期又称恒定期或最高生长期，此时培养液中活细菌数最高并维持稳定。（即细菌分裂增加的数量等于细菌死亡数）3、微生物生长曲线生长曲线(GrowthCurve)定义衰亡期营养物质耗尽和有毒代谢产物的大量积累，细菌死亡速率超过新生速率，呈现出负增长，但仍有部分活菌存在。3、微生物生长曲线微生物生长曲线小结微生物生长曲在发酵中的应用有哪些？

思考连续培养(Continousculture）在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定的生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法。连续培养基本原则：培养过程中不断补充营养物质和以同样的速率移出培养物。4、微生物生长的控制-连续培养控制连续培养的方法恒浊连续培养不断调节流速而使细菌培养液浊度保持恒定恒化连续培养保持恒定的流速4、微生物生长的控制-连续培养（一）恒浊连续培养测定所培养微生物的光密度值自动调节新鲜培养基流入和培养物流出的流速使培养物维持在某一恒定浊度控制措施：当培养室中的浊度超过预期数值时：流速加快，使浊度降低；当培养室中的浊度低于预期数值时：流速减慢，使浊度升高。恒浊培养器的工作精度是由光电控制系统的灵敏度来决定。4、微生物生长的控制-连续培养（二）恒化连续培养使培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率下进行生长繁殖。4、微生物生长的控制-连续培养菌种分离、纯化技术2菌种分离、纯化1、有关概念将特定的微生物个体从群体中或从混杂的微生物群体中分离出来的技术叫作分离。分离纯化在特定环境中让一种来自同一父辈的微生物群体生存的技术叫作纯化。分离后的微生物要进行纯培养；分离技术主要是：稀释和选择培养。2、自然界中菌种分离方法步骤采样增殖培养纯种分离纯培养生产性能测定菌种分离、纯化思考1、微生物分离纯化可分为菌落纯和细胞纯，查阅资料如何操作？2、微生物分离的常用方法有哪些?

菌种保藏3菌种保藏为何要对菌种进行保藏？菌种的衰退；供下次培养使用。1、有关概念衰退（degeneration）：在微生物的生长过程中，由于变异的存在，使原有的优良性状发生负变，即菌种的衰退。复壮(rejuvenation)：狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施；广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。菌种保藏2、防止菌种衰退的方法控制传代的次数采用良好的菌种保藏方法，可以减少移种和传代的次数。创造良好的培养条件利用不同类型的细胞进行接种传代

对丝状微生物而言，通常采用稳定的单核孢子进行接种。采用有效的菌种保藏方法菌种保藏3、菌种的复壮措施纯种分离

菌落纯的分离方法（平板表面涂布法，平板划线分离法，琼脂培养基浇注法）

细胞纯的分离方法（分离小室进行单细胞分离，显微操纵器进行单细胞分离，菌丝尖端切割法进行单细胞分离）通过宿主体内生长进行复壮（如寄生微生物的复壮）淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化条件进行处理，以杀死生命力较差的已衰退个体）菌种保藏菌种保藏菌种保藏的原理：挑选典型菌种的优良纯种一般采用微生物的休眠体（如孢子、芽孢等）创造适于微生物长时期休眠的环境条件（如干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养以及添加保护剂或酸碱中和剂等）菌种保藏常用菌种保藏方法方法名称主要措施适宜菌种保藏期评价冰箱保藏法（斜面）冰箱保藏法（半固体）石蜡油封藏法*沙土保藏法真空冷