木质纤维素降解酶预处理研究进展

木质纤维素降解酶预处理研究进展

制备纤维素酶解的关键底物特性从木材和纤维中合成能源和生物材料，逐步建立生物精炼经济模式，与原油精炼相结合，实现生物精炼与原油精炼的一体化。这是促进中国能源和资源开发的有效对策。在木质纤维素的转化过程中,基于糖平台的生物转化技术由于反应条件温和、环境友好等优点备受青睐。然而,如何高效水解纤维类复杂多糖仍制约着木质纤维素生物精炼的发展。木质纤维素结构复杂、性质稳定,很难被酶或微生物降解。在过去几十年,人们在如何提高木质纤维素酶解效率以及明确纤维素酶解制约因素方面做了大量的研究(图1)。一方面,在工艺上开发了大量木质纤维素预处理技术(包括常规预处理与新型预处理),旨在破坏木质纤维素的顽抗特性,提高酶解效率;另一方面,在机理上剖析制约纤维素酶解的顽抗特性(包括木质素、半纤维素等化学特性;酶可及度、结晶度、氢键等物理特性),旨在明确关键底物特性,反馈指导新型预处理技术开发。由于木质纤维素的顽抗特性以及纤维素仍存在酶水解效率低、纤维素酶价格昂贵等不足,因此,木质纤维素预处理是提高其酶解糖化效率、降低酶使用成本的必要环节,也是目前制约木质纤维素生物炼制的技术瓶颈之一。研究表明纤维素酶解效率的高低很大程度上取决于木质纤维素的预处理效果,即底物各种物化特性的改变情况。美国能源部在纤维素乙醇发展计划中将预处理方式筛选以及关键底物特性确定列为未来5~10年重要研究课题。通过前人的研究,可以清晰理解制约纤维素酶解的关键因素,进而指导预处理方式筛选评价与新型预处理技术开发。本文综述了近几年(2008~2011年)来国内外在木质纤维素预处理技术以及底物顽抗特性方面取得的最新研究进展(图1),并对这些底物特性在不同的预处理过程中的变化以及如何影响木质纤维的酶解效率进行了详细分析和评述。1纤维素与半纤维和木质素木质纤维素主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。其中,纤维素是由D-葡萄糖通过β-1,4糖苷键联结而成的长链分子,长链分子进一步通过氢键等作用力形成具有高度结晶区的超分子稳定结构。同时纤维素周围紧密镶嵌着半纤维和木质素,这种复杂而稳定的结构使得纤维素很难被酶水解。为提高纤维素酶解效率,必须对木质纤维素原料进行预处理。如何通过预处理破坏木质纤维素的顽抗结构,提高纤维素酶解效率受到了国内外普遍关注。木质纤维素预处理方法众多,包括常规预处理及近几年报道的新型预处理技术,这些技术在预处理效果、成本、可操作性、通用性以及规模化应用方面各有优缺点。由于国内外有关常规预处理技术的综述较多,本文只作简单汇总,将重点介绍近几年报道的新型预处理技术,并对新技术的预处理效果及其优势进行分析和评述。1.1半纤维素酶解处理常见的木质纤维素预处理方法有球磨法、稀硫酸法、氨水预处理、石灰预处理、热水预处理、蒸汽爆破法以及生物预处理方法等(表1)。其中,机械球磨法对化学组成基本没有影响,但可以有效减小颗粒尺寸以及降低木质纤维素结晶度和聚合度,从而促进木质纤维素的酶降解,但处理过程能耗较大,且对木质素含量较高的原料预处理效果不明显。稀硫酸处理主要通过水解半纤维素,破坏半纤维素-木质素之间的化学键,达到增大酶可及表面积的效果,同时还可减小纤维素的平均聚合度,酸预处理方法对木质素脱除以及结晶度破坏效果不明显,并且容易产生微生物发酵抑制物,增加了后续处理的难度,此外,稀酸对预处理装置的腐蚀性也是制约其工业化的重要因素之一。碱预处理方法,如氨水浸泡处理、循环氨水处理、石灰预处理等,处理条件较温和,不易产生抑制物,在一定条件下可有效脱除木质素,并伴有少量半纤维素发生水解,可及内表面积增加。碱处理难以破坏木质纤维素的结晶度,与无定形纤维素相比,其酶解时间仍较长,此外,大部分半纤维素残留在固体组分,后续酶解产生的混合糖需要分离或综合利用。蒸汽爆破法与氨气爆破法使纤维素发生机械断裂的同时破坏纤维素内部的氢键,亦可有效去除半纤维素和部分木质素并破坏木质纤维素结构。蒸汽爆破法对设备要求较高,设备投入大,制约了规模化应用。生物法则主要采用白腐真菌或木质素降解酶等降解原料中的木质素,提高纤维素的酶解效率。生物法处理条件最为温和,且过程绿色,但预处理时间过长,目前还难以与化学处理法相媲美。1.2改性木质素预处理近几年来,国内外报道了一些新型的预处理方法(表1),例如:化学组合预处理(如酸碱耦合预处理、纤维素溶剂/有机溶剂预处理)、物理-化学组合预处理(如微波辅助离子液体、微波辅助化学预处理、乙醇蒸煮-球磨法)、物理/化学-生物组合预处理、低温预处理、绿色溶剂法、电化学预处理等。其中,组合预处理综合了单个预处理方法的优点,因此在预处理效果上更为显著。此外,一些新型的绿色溶剂,包括N-甲基氧化吗啉(N-methyl-morpholineN-oxide,NMO)、新型离子液体等,对木质纤维素预处理效果也表现出独有的优势,但目前尚在实验室阶段,规模化放大和处理成本上有待进一步探索。最近,电化学处理法也用于脱除木质素,以提高木质纤维素的酶解效率。整体而言,新型预处理方法在很多方面相比常规方法更具优势,在工业化应用方面也更具可行性。1.2.1纤维素底物及酶解涤纶本课题组提出了木质纤维素酸碱组合预处理工艺,该工艺采用弱酸-弱碱(甲酸-氨水)或强酸-强碱(稀硫酸-氢氧化钠)两步处理木质纤维素原料,脱除了大部分半纤维素和木质素,获得高纤维素含量的底物。木质纤维素经酸处理后,由于保留了大部分木质素,使得后续酶降解效果并不理想。而酸碱两步处理后,非纤维素类物质基本脱除,酸处理产生的抑制物也得以大幅度减小,其纤维素酶解率显著提高。甲酸处理虽然亦可有效分离木质纤维素三大组分,但有可能引起纤维素聚集,从而大大减小了酶可及表面积,酶解效果不明显。经过后续氨水浸泡处理,在温和条件下,即可显著增大底物的酶可及表面积,纤维素水解率从35%提高到85%。特别地,经过酸碱组合预处理的底物,由于密度高,非纤维素类物质少,非常适合后续高固反应(在相同条件下黏度低),研究表明固液比(质量/体积)可从常规的5%~7.5%提高到19%,通过分批补料策略可进一步提高到25%。高纤维素含量底物在高固液比条件下酶解发酵,可获得高浓度的燃料乙醇,进而降低后续乙醇蒸馏成本。Zhang等提出了纤维素溶剂-有机溶剂组合预处理方法。该方法采用浓磷酸作为纤维素溶剂,丙酮作为有机溶剂,在温和(常压,50℃)条件下处理木质纤维素原料。高浓磷酸(>83%)显著破坏了木质纤维素的结晶度,后续的丙酮处理和水洗过程分别去除了木质素和水溶性半纤维素水解糖,经处理得到的无定形的纤维素底物,在4h内即可达到80%以上的水解率。最近,该研究小组还报道了一种改进的纤维素溶剂-有机溶剂组合预处理方法,即利用乙醇代替丙酮作为有机溶剂。与丙酮相比,乙醇成本低、化学性质稳定,无毒,且回收要求低(可在发酵后继续回收)。虽然乙醇脱除木质素能力有限,但是该方法在去结晶度和脱除半纤维素方面依然显著,即使在超低酶用量[1FPU·(gglucan)-1]情况下仍可达到非常理想的水解效果(>88%)。纤维素溶剂-有机溶剂组合预处理方法最显著的优势在于破坏了木质纤维素的结晶度,获得了无定形的底物,与常规方法相比,后续酶用量大幅度减少,酶解时间大为缩短,是一种极具潜力的木质纤维素预处理方法。1.2.2微波辅助的组合预处理工艺目前,已报道的物理-化学组合预处理方法主要有乙醇蒸煮-球磨法、加压热水-球磨法、微波-离子液体预处理等。其中,在乙醇蒸煮-球磨法处理过程中,木质纤维素经乙醇蒸煮后,更适用于后续的球磨处理,两步处理后底物颗粒尺寸减小,结晶度也发生了破坏。相比常规的硫酸-乙醇蒸煮预处理工艺,本工艺避免了硫酸的使用,以及随之产生的单糖降解、设备腐蚀、抑制物脱除等问题;在加压热水-球磨法组合处理过程中,半纤维素在加压热水中发生部分水解,破坏了木质纤维素的完整性,可减少后续球磨时间,降低预处理能耗。与单独高压热水预处理相比,该工艺还可以显著减少酶用量(从每克底物40FPU减少到4FPU),因此更具经济可行性。除了球磨法处理外,微波也是一种常见的物理处理方式。基于微波协助的组合预处理工艺也已见报道。其中,在微波-离子液体预处理体系中,微波显著加强了纤维素在离子液体中的溶解性,同时也减小了纤维素的聚合度。此外,微波-酸处理、微波-碱处理等组合预处理工艺也均表明微波处理有助于提高纤维素的酶解效率。1.2.3预处理+p.ostrorachio目前生物预处理主要存在预处理周期长、效率低等问题。为此,Yu等报道了一种物理/化学-生物组合预处理工艺,利用超声或双氧水(H2O2)温和预处理后再用P.ostreatus微生物脱除木质素。超声或H2O2处理后木质纤维素结构发生了破坏,有助于微生物进入内部,提高了木质素脱除效率。相比单独微生物预处理,组合预处理大幅度减少了反应时间,也减小了糖组分的损失,因此更具可行性。1.2.4温度-15法目前大部分的木质纤维素预处理在常温或高温条件下进行。文献[42-45]报道了一种新型的低温预处理方式,如NaOH-尿素低温预处理。该方法基于纤维素在低温(-15℃)NaOH溶液中的溶解特性,可破坏木质纤维素的顽抗结构,增大木质纤维素颗粒的松散度。此外,低温条件下溶液凝固过程中体积膨胀,也有助于破坏纤维素内部结构,增大酶可及表面积。在7%NaOH-12%尿素处理条件下,相比中温预处理(60℃),纤维素转化率提高了两倍。由于低温处理条件特殊,在寒冷地带或冬季,可在室外直接预处理,不需额外耗能,是一种很有应用价值的预处理方式。1.2.5nmo预处理N-甲基氧化吗啉(NMO)是一种工业纤维素溶剂,最近有报道用于处理高结晶度的木质纤维素。随着NMO溶剂浓度的下降,NMO与木质纤维素作用模式从溶解(NMO浓度85%)、膨胀(79%)到溶胀(73%)变化。其中,高浓度NMO下溶解模式是最有效的预处理方法,该条件下完全打破了纤维素链之间的氢键和减弱范德华力,使得纤维素结晶度显著降低。NMO预处理效果明显、处理条件相对温和,且NMO具有安全无毒、可生物降解、易回收等优点,有望成为一种有潜力的木质纤维素预处理方法。离子液体应用于溶解再生纤维素预处理早有报道,例如[Amim][Cl]、[Bmim][Cl]离子液体。近年来,报道了一些新型离子液体用于处理木质纤维素,其中,[Emim][CH3COO]是一种选择性溶解木质素的离子液体,纤维素在该溶剂中难以溶解,但结晶度发生了明显的破坏,尤其是当木质素脱除40%后。木质素的脱除以及纤维素结晶度的下降,使得底物酶解效率达90%以上。目前,离子液体虽然可回收再利用,但与常规预处理方法相比,其成本仍然较高,因此,新型离子液体的设计、低成本合成与回收还需大量研究,为木质纤维素高值转化利用提供预处理试剂。1.2.6木质素的应用最近,制浆工艺中用于漂白的电化学处理过程引起了预处理研究者的兴趣。在最初的制浆漂白工艺中,利用电化学作用去除具有颜色的木质素,保留了维持纸张机械强度的纤维素和半纤维素。由于该方法具有很好的去除木质素效果,所以被尝试应用于木质纤维素的预处理。电化学处理过程中,通过电解NaCl得到富含HClO的电化学活化水,进而对木质纤维素发生作用。实验证明该过程可有效脱除木质素,提高酶解效果。电化学方法在温和反应条件下进行,易规模化,且不需要加入化学试剂,是一种环境友好的预处理方法。为降低预处理成本,除了预处理方法设计和改进之外,提高底物浓度也是重要的措施之一。在这方面,近年来已报道了多种高底物浓度预处理工艺,包括高固CO2-H2O预处理、高固氨水预处理、高固稀硫酸蒸汽爆破等。这些预处理工艺在保证高酶解效率情况下,减少了化学药品的投入和水的消耗,因此在规模化应用方面更具优势。2不同结构特性对纤维素酶解的影响木质纤维素顽抗特性(包括化学特性和物理特性)对纤维素酶解糖化的影响如图2所示。其中,化学特性主要有木质素和半纤维素;物理特性主要有聚合度、结晶度、氢键、可及表面积和酶可及度。这些结构特性在木质纤维素预处理过程中发生了不同程度的破坏,从而提高纤维素的酶解效率。在特定预处理条件下,这些结构也并非单一性改变,而是互相联动变化。因此,准确描述单个顽抗特性对纤维素酶解的影响机制仍较为困难,尽管如此,经过大量的研究,可以较清晰地了解木质纤维素的顽抗特性及其对纤维素酶解的影响规律。下面分别讨论各顽抗特性在预处理过程中的变化,并分析其对酶解糖化的影响机制。2.1化学特征2.1.1酶解纤维素木质素是由苯丙烷结构单元组成的一类复杂的芳香聚合物。在木质纤维素中,木质素与半纤维素以化学键链接,并缠绕和包裹在纤维素周围,阻碍了纤维素酶与纤维素的接触。因此,很多预处理方法都是旨在脱除木质素来解除对纤维素的包裹。碱处理可以破坏木质素和半纤维素之间的化学键,具有较强的脱木质素能力,如氨水浸泡、氨爆处理和石灰预处理等。此外,超声/H2O2-生物组合预处理亦可有效脱除木质素。木质素(不同含量与种类)主要通过以下两种作用方式影响纤维素的酶解效率:(1)阻碍纤维素酶分子接近纤维素糖苷键;(2)木质素对纤维素酶产生不可逆吸附,大大降低了纤维素酶的有效性。据报道,木质素的疏水性是产生纤维素酶无效吸附的一个重要因素,在酶解过程中加入表面活性剂(如吐温)或非离子化合物(如牛血清蛋白、聚乙二醇等)与酶蛋白产生竞争吸附,可提高纤维素酶解效率。木质素制约纤维素酶解早有报道,近年来,Zhu等提出脱木质素对纤维素水解程度有影响,但对初始酶解速率影响不明显。当木质纤维素结晶度破坏时,高木质素含量的底物仍可在短时间内达到高的水解率。可能原因是底物结晶度破坏后,结构松散,可及表面积增大,酶很容易甚至优先与纤维素结合,此时木质素阻碍和无效吸附作用不足以影响纤维素的酶解。本课题组结果亦表明在较大的酶可及表面积情况下,含少量木质素[如<10%(质量)]的底物也能达到高的酶解转化率。因此,在预处理过程中并非必须完全脱除木质素。2.1.2半纤维素含量对酶活性的影响半纤维素是主链由木聚糖或半乳糖等组成,且带有支链的一类结构不同的多聚糖。半纤维素聚合度低,无结晶结构,在酸处理(如稀硫酸)过程中容易发生水解。半纤维素的水解会导致木质纤维素结构发生变化,可使纤维素酶更容易接近纤维素。Jeoh等考察了稀硫酸预处理后玉米秸秆中半纤维素含量对酶可及度的影响规律。研究发现:反应1h吸附在底物上纤维素酶浓度随着半纤维素(木聚糖)含量的减少而增大,由此直观证明了半纤维素含量的减少有利于底物对纤维素酶的吸附;而玉米秸秆经氨水浸泡处理后,半纤维素含量基本不变,但是纤维素酶解转化率可达85%以上,这是由于目前商业化纤维素酶(如SpezymeCP)基本上都含有木聚糖酶,当半纤维素与木质素之间的化学键发生断裂后,在酶解过程中,多种酶共同作用,相互促进,可以有效降解纤维素和半纤维素。2.1.3对质层的影响蜡质是覆盖在木质纤维素表层的角质蜡状膜,其化学组成极其复杂,目前总共鉴定出了一百多种组分,包括脂肪酸、烷烃、脂肪醇、醛类、酮类、酯类化合物等。蜡质为脂溶性物质,可由有机溶剂(如乙醇、苯)提取。在美国可再生能源实验室标准方法(NRELLAP10)中,采用乙醇提取法测定木质纤维素中脂溶性物质的总含量。但由于蜡质组成复杂,且木质纤维素中还有其他脂溶性成分(如叶绿素),因此目前还难以准确测定其含量。基于蜡质的脂溶性,一些有机溶剂预处理,如乙醇蒸煮、磷酸-乙醇、磷酸-丙酮等,可破坏木质纤维素表层的蜡质层。Chen等采用蒸汽爆破-乙醇提取法处理小麦秸秆,化学分析能谱测试结果发现乙醇提取后秸秆表层的O/C值增大,这有可能是乙醇脱除了蜡质层和部分木质素,从而提高了暴露在表面的纤维素含量。最近,Han等考察了蒸汽爆破预处理对木质纤维素表面润湿性的影响,结果发现预处理后表面接触角明显减小(由90°可减小到约60°)。由于蜡质层的存在可阻碍水分子对木质纤维素表面的润湿,因此,接触角减小则表明蒸汽爆破处理破坏了表面的蜡质层。已有研究证实了蜡质具有防止木质纤维素被有害光线损伤、维持表面清洁与表面防水、避免被微生物侵害等作用。在木质纤维素酶解方面,蜡质层对纤维素的包裹及其疏水特性可阻碍酶分子接触纤维素表面,但直接定量考察蜡质层对纤维素酶解的影响目前还鲜见报道。2.1.4预处理技术研究木质纤维素,特别是农林废弃物,含有较多的无机物,包括硅、钙、钾、铝等离子及其化合物。无机物组成复杂,一般采用水洗提取和高温灼烧处理测定其总含量。针对无机物离子,亦可采用电感耦合等离子体原子发射光谱法进行定量测定。由于大部分预处理过程均在水溶液中进行,如氨水预处理、稀硫酸预处理等,因此这类预处理技术均可除去水溶性无机物和部分无机物小颗粒。此外,研究表明蒸汽爆破预处理有助于无机物的溶解,进而得以脱除。木质纤维素中无机物含量一般在5%~15%,这些无机物在纤维素酶解过程中溶解在溶液中。Chen等系统考察了蒸汽爆破处理后稻草中无机物离子对纤维素酶解的影响,研究发现多数无机阳离子,包括K+、Mg2+、Ca2+、Al3+、Mn2+、Fe3+、Cu2+和Zn2+,均一定程度上制约了纤维素酶的水解酶活,这些离子中只有Ca2+和Mg2+对β-葡萄糖苷酶酶活具有促进作用。与预处理后不水洗相比,水洗操作可使得纤维素酶解效率提高12.5%,这进一步证实了无机物离子对纤维素酶的制约作用。2.2物理特性2.2.1外接酶系统基因酶解效果纤维素聚合度是指纤维素分子中葡萄糖单元的数量。目前常用的聚合度测定方法有黏度法和凝胶渗透色谱法。木质纤维素聚合度降低,可暴露出更多纤维素链还原末端,使外切纤维素酶容易进攻,增强酶解效果。目前主要从初始聚合度和水解过程中聚合度的变化来考察其对纤维素降解的影响规律。由于木质纤维素预处理导致聚合度变化的同时也会引起其他物理特性的变化,如结晶度、可及表面积等,因此难以准确描述聚合度的影响机制。此外,一些预处理过程并未改变聚合度,亦可达到高效酶解。2.2.2纤维素在水泥、微生物和离子液体预处理的过程中水解速率和水率的变化纤维素的结晶度可采用X射线衍射法、固态13C核磁共振法、红外光谱或拉曼光谱进行测定。早期的研究主要以纯纤维素为研究对象,纤维素经溶剂处理再生或球磨处理后发现结晶度的破坏提高了水解效率。近年来,利用一些新预处理技术,例如磷酸-丙酮(乙醇)、微波-离子液体、NMO预处理等,破坏了纤维素的高度结晶区,处理后纤维素水解速率和水解程度也均显著提高。另一方面,木质纤维素经氨水或稀硫酸处理后纤维素结晶度并未降低,而且由于木质素和半纤维素等无定形物质的脱除,底物相对结晶度指数反而有所提高,但纤维素在较长时间酶解后(如24h),也能大部分降解。这些结果表明:结晶度的破坏有助于提高水解速率和可水解程度,而高结晶度的纤维素呈现出较慢的水解速率,但在其他底物特性(如可及内表面积)改变后亦能达到高的可水解程度。无定形纤维素能同时被内切葡聚糖酶(EG)和外切葡聚糖酶(CBH)水解,EG随机剪切无定形纤维素分子的糖苷键,产生大量供CBH作用的新的分子链末端,而结晶纤维素主要被CBH水解,EG和CBH两类水解酶的协同作用在提高纤维素水解速率方面显得尤为重要。2.2.3纤维素分子间氢键强度对酶解效果的影响木质纤维素中纤维素和半纤维素都含有大量的羟基,所以分子内和分子间氢键是木质纤维素一个重要的物理特性。通过红外光谱、固体核磁技术以及借助经验公式可定量描述木质纤维素分子内/间氢键强度。研究发现纤维素的氢键对纤维素的结晶度有很大的贡献,随着木质纤维氢键强度(可能是分子间氢键起决定作用)的破坏,结晶度降低。本课题组系统考察了多种预处理过程中木质纤维素氢键强度的变化及其对纤维素酶解的影响。结果表明分子间氢键的降低有助于促进纤维素的水解。酸处理过程中可能由于氢离子的干扰,分子间氢键有一定程度的增强,纤维素后续酶解效果不显著;而碱处理后分子间氢键发生了破坏,纤维素水解率也相应提高。2.2.4预处理对木质素酶可及度的影响在木质纤维素酶解过程中,酶分子首先要扩散到底物表面或进入内部孔道才能发生作用。因此,底物的可及表面积(包括可及内、外表面积)是控制纤维素酶解效率的一个关键因素。可及内表面积一般通过溶质排斥法(soluteexclusiontechnique)和染色法测定。溶质排斥法以不同分子直径的右旋糖苷或聚乙二醇为分子探针,通过测量渗入木质纤维素内部孔道的溶质来确定孔体积和可及内表面积。由于该方法是在木质纤维素湿润状态下进行,因此很接近酶解过程的真实环境。利用溶质排斥法对预处理前后的木质纤维素进行分析,发现纤维素酶解速率和酶解程度与孔径大于5.1nm的可及内表面积呈正比。该孔径大小与外切葡聚糖酶CBH1催化位点结构尺寸(5nm×6nm×4nm)相当。目前报道的预处理方法都能在一定程度上提高木质纤维素的酶可及内表面,如碱预处理、蒸汽爆破预处理、离子液体预处理等。此外,利用膨胀素、类膨胀素蛋白和其他非水解酶蛋白亦可提高底物的酶可及内表面积,促进纤维素的水解。在可及外表面积方面,早期研究通过考察颗粒尺寸来间接评价可及外表面积的影响。研究发现颗粒尺寸经化学处理后无明显变化,对纤维素酶解转化率几乎没有影响;而Zhu等利用机械碾磨法改变云杉的颗粒尺寸,结果表明增大外比表面积有助于纤维素的水解。实际上,颗粒尺寸与外比表面积并不呈线性关系,当颗粒尺寸相当时,其体积密度或孔隙率很大程度上影响着外比表面积的数值。因此,综合考虑底物孔隙率和颗粒尺寸,准确定量可及外表面积是评价其影响机制的关键。2.2.5纤维素酶可及度木质纤维素底物特性较多,并且在预处理过程中发生联