儿茶素没食子酸酯egcg茶多酚的分离与纯化

儿茶素没食子酸酯egcg茶多酚的分离与纯化

茶叶中含有大量多元的酚类化合物，这些物质被统称为茶多酚，占茶叶干重的18%36%。茶多酚具有很强的抗氧化能力,可以作为天然食品抗氧化剂,更重要的是茶多酚还具有防癌抗癌的药理功能,在医药方面有着光明的前景。作为茶多酚主体成分的儿茶素约占茶多酚总量的70%～80%,其中又以表没食子儿茶素没食子酸脂(EGCG)含量最高,占儿茶素总量的50%～60%。大量研究表明,EGCG对肝癌和胃癌具有明显的预防和治疗效果。所以提取富含儿茶素EGCG的茶多酚和分离儿茶素单体EGCG一直是茶叶领域研究的热点。但由于儿茶素类化合物物理性质十分相近,给提取和分离带来了难度。目前,提取茶多酚的方法主要有两种:有机溶剂萃取和金属盐沉淀法;分离儿茶素的方法多种多样,有采用HPLC分离,HSCCC分离,也有用葡聚糖凝胶分离。本试验对传统的茶多酚提取方法进行了改进——在传统的有机溶剂萃取法的基础上,用等体积的柠檬酸水溶液酸洗,得到富含EGCG的茶多酚,给分离EGCG单体的工厂化生产提供了新的思路和方法;同时把富含EGCG的茶多酚提取与高速逆流色谱(HSCCC)分离儿茶素单体联系起来,得到高纯度的EGCG,这将有利于EGCG在食品及日用化工领域的广泛使用。1材料和方法1.1仪器、检测方法高速逆流色谱(HSCCC,GS10A3型,北京天纯维通生物技术有限公司),高效液相(HPLC,waters、600controller),液相色谱柱(100mm×4.6mm,NuclesilC183μm),旋转蒸发仪(R-201,上海申顺生物科技有限公司),真空干燥箱(MMMMedcenterEinrichtungenGmbH.D-82166Grafelfing,Germany),电子天平(TB-214,北京赛多利斯仪器系统有限公司)。1.2仪器和试剂供试茶样:黟县条茶(购于安徽农业大学茶厂),表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG,TEAVIGOTM),咖啡碱(无锡绿宝有限公司),甲醇(色谱级,TEDIAcompany),乙腈(色谱级,TEDIAcompany),乙酸乙酯(分析纯,无锡亚盛化工有限公司),无水Na2SO4(上海东懿化学试剂公司),柠檬酸(上海东懿化学试剂公司)。1.3测试方法1.3.1元线性回归方程分别配置0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg·mL-1等5个浓度的EGCG溶液,按1.3.3方法经液相检测,以浓度为自变量,峰面积为因变量,进行线性回归分析,求得一元线性回归方程y=7E+06x+129255(R2=0.9992),同理,咖啡碱峰面积与浓度的回归方程为y=1E+07x+11445(R2=0.9986)。1.3.2不同萃取方法的提取样品中柠檬酸的检测方法为在70℃条件下,用80%的乙醇水溶液浸提茶叶30min,料液比为1∶15,重复浸提3次。所得到的茶汤在35℃真空旋转浓缩除去乙醇,然后把茶汤等体积分成6份,分别采用不同方法进行处理:1.氯仿萃取1次,乙酸乙酯萃取2次;2.氯仿萃取1次,乙酸乙酯萃取2次,0.9%柠檬酸酸洗2次;3.乙酸乙酯萃取2次,0.9%柠檬酸酸洗2次;4.乙酸乙酯萃取2次,0.9%柠檬酸酸洗1次;5.乙酸乙酯萃取2次,0.6%柠檬酸酸洗1次;6.乙酸乙酯萃取2次,0.3%柠檬酸酸洗1次。所得乙酸乙酯中加入少量的无水Na2SO4静置脱水,减压回收乙酸乙酯,然后放入真空干燥箱干燥,分别得到TP-1、TP-2、TP-3、TP-4、TP-5和TP-6。1.3.3样品的制备方法采用A、B两相梯度洗脱,A相是2%的乙酸(8%～17.3%),B相是乙腈(92%～82.7%);流速是1.2mL·min-1,时间21min。样品的制备:分别称取6种不同提取方法制备的茶多酚和HSCCC分离TP-3得到的EGCG0.01g,用水配成1mg·mL-1的10mL溶液,并经过0.45μm微孔滤头过滤,待测。每次进样量为5μL。1.3.4流动相的配置HSCCC的分离条件:流速为1mL·min-1,泵速为800r·min-1,紫外检测波长280nm,HSCCC的进样量2mL。流动相与固定相的配置:乙醚、乙酸乙酯、水按一定比例摇匀、静置、分层,上层是固定相,下层是流动相。样品制备:分别称取TP-1、TP-30.2g,溶与2mL的流动相中,其浓度为100mg·mL-1,待分离。1.3.5咖啡碱的计算公式根据EGCG的峰面积与浓度的线性相关,得到茶多酚中EGCG含量计算公式如下,Y是峰面积。同理得到咖啡碱的计算公式(略)。EGCG/%=Y−1292557E+06×1010×100%EGCG/%=Y-1292557E+06×1010×100%1.3.6ecgg%的测定T=Y−12925510×107E+06×Z0.3×EGCG%×32Τ=Y-12925510×107E+06×Ζ0.3×EGCG%×32式中,Y是EGCG的峰面积,Z是HSCCC对茶多酚分离制备的EGCG,EGCG%是被分离茶多酚的EGCG的百分含量。2不同提取工艺对ecgg得率的影响液相检测TP-1到TP-6的色谱图结果如下。由色谱图(图1)可见提取过程中使用氯仿的(TP-1、TP-2)咖啡碱峰要比未使用的(TP-3到TP-6)低,同时使用酸洗的(TP-2到TP-6)EGCG峰要比未使用酸洗的(TP-1)峰高。根据提取结果、液相检测结果结合1.3.5计算方法得到表1。从表1中数据结果看出,提取过程中使用氯仿的(TP-1、TP-2)的咖啡碱含量要比没有使用氯仿萃取的其他几组低的多,而其EGCG得率也比其他几组低,主要是在使用氯仿提取过程中,氯仿易产生乳化,而影响EGCG的得率;提取过程中使用酸洗的(TP-2到TP-6)茶多酚得率要比未使用酸洗的(TP-1)低的多,因为在酸洗过程中,一些非酯型儿茶素和亲水物质被洗去,但EGCG的含量基本不变;酸洗的次数对EGCG的富集也很明显,用0.9%的酸溶液酸洗2次的TP-3的EGCG含量要比酸洗1次的TP-4高16.75%,但EGCG的得率降低0.13%,所以酸洗的次数不宜过多;比较TP-4、TP-5、TP-6的EGCG含量,不难发现酸洗时酸的浓度对EGCG含量的提高有影响,随着浓度的增加,EGCG的含量增加,但得率却在降低。为了提取得到富含EGCG的茶多酚,同时又考虑到EGCG的得率,所以选择TP-3的提取工艺。从分离TP-3的HSCC(图2)可以看出,TP-3中的4种物质A、B、C、D分得较开,根据HSCC色谱图2合并相应的收集液,分别上HPLC检测,结果如图3。而泵中推出的固定相是表儿茶素没食子酸酯(图3E)。把峰D对应的液体减压浓缩,然后真空干燥,得到EGCG干样0.132g。在同等条件下分离TP-1得到EGCG0.078g。所以,用富含EGCG的茶多酚为原料,HSCCC来分离获取EGCG单体降低了成本,提高了效率。由图4可以看出,分离后的EGCG纯度要比分离前纯度高,根据图4中液相色谱图B中EGCG峰的峰面积7.0×106,结合1.3.5的计算方法,可以计算出HSCCC分离得到的EGCG纯度达到98.2%。再根据1.3.6的计算方法,比较分离前后EGCG的绝对量,可知HSCCC分离儿茶素的回收率是87.6%。3ecgg含量对茶多酚含量的影响本试验在传统的茶多酚提取方法基础上,应用柠檬酸溶液酸洗,除去非酯型儿茶素