青藤碱脂质体的制备工艺研究

青藤碱脂质体的制备工艺研究

青藤碱是预防感冒和类风湿性关节炎的常用药物。由于其生物半衰期短,大鼠体内的t1/2仅为48.50min,因此代谢较快。目前市场上青藤碱的普通制剂,如片剂、注射剂等,需频繁用药才能达到治疗效果,在临床应用受到一定的限制。以脂质体为载体,将青藤碱制成关节局部应用的经皮给药制剂,可减少药物的全身吸收,使药物集中于皮肤角质层,形成药物贮库,缓缓向关节部位释药,从而降低药物的毒副作用,提高其生物利用度。而且脂质体本身的成分一般为体内所固有,无皮肤刺激等毒副作用。脂质体经皮给药制剂已成为当前局部给药制剂发展的一个趋势。本研究采用适合于批量生产的注入法制备青藤碱脂质体,并采用混料均匀设计法优化青藤碱脂质体的膜材处方,在此基础上进行制备工艺研究,为青藤碱经皮给药制剂的研究开发提供实验依据。1仪器、试剂与药品SummitP680型高效液相色谱仪,PDA-100型二极管阵列检测器,ASI-100型自动进样器(德国Dionex公司);CQF-50型超声波清洗器,中船七院七二六所;JEM-2010HR型高分辨透射电子显微镜,日本JEOL公司;青藤碱对照品(中国药品生物制品检定所,批号0774-9904);青藤碱结晶(自制,制备工艺用);大豆卵磷脂(上海伯奥生物科技有限公司);胆固醇(上海源聚生物科技有限公司);维生素E(广州万利隆化工有限公司)。均匀设计软件:UD3.0版(中国数学会均匀设计分会)。2方法和结果2.1脂质体包封率的测定处方以青藤碱、豆磷脂、胆固醇、维生素E(抗氧化剂)组成。以四者在其变量范围内的百分含量作自变量,分别设为XA,XB,XC,XD,所得脂质体的包封率为因变量,进行处方优化。经预试验确定4个自变量组成范围,同时考虑归一化条件,给出均匀设计的约束限制条件:在该限制条件下进行4因素的混料均匀设计,采用U9(94)表,由UD3.0均匀设计软件安排试验,因素水平见表1。2.1.2碱、豆酸钠缓冲液、胆固醇、维生素e采用注入法制备脂质体。按表1中的处方比例(总量设定为1000mg),称取青藤碱、豆磷脂、胆固醇、维生素E,加乙醚50mL使溶解;另取pH7.4磷酸盐缓冲液50mL,置烧杯中,加热至50℃并保持恒温,在不断搅拌下匀速注入乙醚溶液,加完后继续搅拌1h至乙醚挥尽。超声处理10min,即得乳白色脂质体混悬液。2.1.3青藤碱包封率测定按照前期建立的方法测定包封率。精密量取青藤碱脂质体混悬液0.5mL,加于SephadexG-50凝胶柱顶部,以pH7.4磷酸盐缓冲液洗脱,流速1mL·min-1,收集4~11mL洗脱液,用氮气吹至体积约0.5mL,加无水乙醇定容至10mL,摇匀。精密量取10µL溶液,进样,测定峰面积,用外标一点法计算青藤碱的含量,计为Mlip;另精密吸取青藤碱脂质体混悬液0.5mL,用无水乙醇定容至10mL,摇匀。精密吸取10µL溶液,同法测定,计为Mtot,按下式计算包封率。各处方下包封率测定结果见表1,HPLC见图1。包封率计算公式:包封率(EN%)=(Mlip/Mtot)×100%Mlip为脂质体中包封的青藤碱量;Mtot为脂质体混悬液中所含青藤碱总量。2.1.4回归方程结果由于XA+XB+XC+XD=100%,如限定其中3个因素的水平,则另一因素的水平即可确定。本实验选择XA,XB,XC含量为回归自变量,对因变量包封率作配方回归,分别用一阶和二阶规范多项式建立回归方程,求出最优回归子集,并求其最优解。规范多项式计算公式如下:一阶回归结果:方程Y=73.41-67.94XA–4.70XC,R=0.4907,s=7.3088。方差分析结果见表2。查F临界值表,得F0.05(2,6),F=0.9513,回归方程无显著意义。二阶回归结果:方程Y=147.83-1171.71XA+1150.17XAXB+1455.91XAXC-119.57XBXC-285.93XCXC,R=0.9909,s=1.5972。方差分析结果见表3。查F临界值表,得F0.05(5,3)=9.01,F=32.4951,回归方程有显著意义。由回归处理结果可见,二阶回归复相关系数接近于1,残差标准差相对较小,结果有显著意义。因此,选用二阶方程进行模型分析,求出最大解,得出最优处方配比为:XA=8.92%,XB=60.35%,XC=28.81%,XD=1.91%。将以上结果代入回归方程,求得在此配比条件下的预测包封率Y=75.36%。2.2维生素a、g、维生素e制备按脂质体膜材的优选处方配比,称取青藤碱89mg,豆磷脂604mg,胆固醇288mg,维生素E19mg,加乙醚50mL使溶解,共制备4份;另分别取磷酸盐缓冲液25,50,75,100mL,置烧杯中,加热至50℃并保持恒温,在不断搅拌下匀速注入乙2.3包封率的测定按上述优选处方称取青藤碱、豆磷脂、胆固醇、维生素E,加乙醚50mL使溶解,共制备4份;另取磷酸盐缓冲液50mL4份,置烧杯中,分别加热至40,50,60,70℃并保持恒温,在不断搅拌下匀速注入乙醚溶液,加完后继续搅拌1h至乙醚挥尽,超声处理10min,得脂质体混悬液。分别测定包封率,结果见表5。可见制备温度为50℃时,所得脂质体的包封率最高。2.4超声处理包封率的测定按上述优选处方称取青藤碱、豆磷脂、胆固醇、维生素E,共取5份,分别加乙醚50mL使溶解;另取磷酸盐缓冲液50mL,置烧杯中,加热至50℃并保持恒温,在不断搅拌下匀速注入乙醚溶液,加完后继续搅拌1h至乙醚挥尽,分别超声处理5,10,20,30,40min,得脂质体混悬液。分别测定包封率,结果见表6。可见超声时间从5~20min间包封率逐渐递增,而20min后包封率逐渐递减,因此超声时间确定为20min。2.5透射电子显微镜psm观察将青藤碱脂质体置透射电镜下观察。采用磷钨染法制样,取1滴脂质体乳液滴于点滴反应瓷板的凹槽内,将喷碳铜网置于试液上(膜面向下),1~2min后取出铜网,用滤纸从铜网边缘吸干多余液体;按上述同样方法,将该铜网放在染液滴上(4%磷钨酸溶液,pH6.5)约30s,用滤纸从铜网边缘吸干多余染液,自然挥干,用透射电子显微镜观察并拍摄照片,见图2。从照片可以看出,不同粒径的脂质体形态完整,双分子膜结构清晰,均属于单室脂质体,经激光粒度分析仪测定,平均粒径约200nm。3脂质体配方均匀设计试验本研究前期已对青藤碱脂质体的制备方法进行了筛选,比较了薄膜分散法、逆相蒸发法及乙醚注入法的包封率,结果确定采用乙醚注入法进行制备。本研究进一步采用有约束混料设计法优选注入法制备脂质体的配方,并采用单因素考察法优选了注入法工艺的制备条件,按优化后工艺制备的脂质体包封率可达76.21%。在实验中发现,外水相的用量也影响脂质体的包封率,随着磷酸盐缓冲液用量的增大,包封率呈下降趋势。可能由于脂质体在外水相比例扩大后,溶液得到稀释,脂质体内被包封的药物易从内向外渗漏。究采用的混料均匀设计作为一种处方优化试验方法,亦称为配方均匀设计,是均匀设计中的重要组成部分。试验中,每个因素的贡献被表示为其在处方中所占配比,所有因素总和为100%。在此条件下对各因素变量进行边界约束,并进行均匀设计,通过试验求出最优解,从而计算和推测最佳混料比。与传统的均匀设计相比,混料均匀设计只需给出期望的实验次数以及各因素的水平范围,不必给出具体水平,所以各试验点的设置更具代表性和合理性,试验次数更少,优化结果更加稳定和准确;此外,在制剂处方配比设计中,传统的均匀设计优化所确定的组分总用量不恒定,导致制剂的总量也随之波动,从而造成总体积或重量的不确定性;而有约束混料均匀设计可将处方组分总量设定为100%,