蜜蜂转基因技术研究进展

蜜蜂转基因技术研究进展

转换技术是指将外源基因导入受体，通过互补细胞和环境矩阵将外源基因整合到受体矩阵，并从外源基因中获得表达和遗传的生物技术。动物转基因技术在探讨基因功能、基因治疗、发育调控、动物遗传改良、生物制药、建立疾病动物模型、器官移植等领域都有广泛的应用。自1976年Jaenisch首次利用反转录病毒感染胚胎的方法获得了转基因小鼠之后,转基因的猪、牛、羊、鸡、绵羊等相继诞生。尽管转基因动物还存在生产效率低、转基因在受体基因组内行为难以控制、产品的安全性存在着争议等问题,但是转基因动物的科研价值和商业价值促进了转基因技术的不断发展和在各个领域的深入应用。动物转基因的关键问题是如何将外源目的基因导入受体细胞,并使之整合到基因组中。目前使用的动物转基因技术包括显微注射法、反转录病毒感染法、扎刺法、胚胎干细胞法、精子载体法、电击法、基因打靶技术等。蜜蜂Apisspp.为人类提供了具有很高营养保健价值的蜂产品(如蜂蜜、蜂王浆、蜂胶、蜂花粉等),其授粉带来的价值也远远超过了蜂产品本身的价值。同时蜜蜂是典型的社会性昆虫,群内分工明确,个体与个体间有丰富有趣的信息交流方式,社会性行为丰富,是研究社会行为学、神经生物学、行为遗传学、免疫学等的很好的模式生物。对蜜蜂信息交流(如蜂舞)、级型分化、性别决定、劳动分工、认知行为等的研究不仅能解开蜜蜂世界的谜底,也有助于研究其它社会性昆虫甚至自然界的普遍规律。例如,Beye等以蜜蜂为实验材料研究发现csd基因是单倍二倍体生物性别决定的开关基因。蜜蜂转基因研究的意义不仅仅在于改善蜂群生产力和授粉力等一些表观的经济性状,更重要的是在于转基因蜜蜂在基础理论研究中的应用。例如,近年来的差异表达研究已经鉴定出了部分与行为、年龄或组织相关的差异表达基因,但这些基因在蜜蜂生命过程中的具体功能有待进一步研究。利用转基因技术将目的基因转到特定生理阶段蜜蜂的特定组织,是研究这些基因功能的可选途径。本文旨在概述动物转基因技术在蜂学领域的应用现状及探讨今后蜜蜂转基因的研究思路。1网络规划与基因转导Milne等对意大利蜂Apismelliferaligustica显微注射技术作了初步的研究。他们在室温下将1日龄卵放到粘附有胶条的载玻片上,在卵上覆盖一层低粘滞度的石蜡油,使用显微操作器向意蜂卵注射石蜡油后,将卵放入35℃的保温箱中孵化,并观察了注射后卵的发育。结果表明,注射后卵的孵化率平均为21%,而且平均孵化时间比那些只放在石蜡油中的或在巢脾中的发育时间明显要长。该研究初步探讨了蜜蜂显微注射的体系,但试验中注射的只是一种高粘滞的石蜡油,而不是外源DNA。因此,外源基因能否通过该方法整合到蜜蜂基因组上并有效地表达尚不得而知。邵瑞宜等用显微注射技术给1日龄中华蜜蜂A.ceranacerana卵注射石蜡油,得到了与Milne等人在意蜂上的相似结果。Robinson等研究了精子介导转染法用于蜜蜂转基因的可行性。将多种线性DNA分别与雄蜂精子按一定比例混合用于处女王人工授精。处女王授精后,立即剪短一侧翅膀,介绍入无王群内。其后代蜂王均用未经处理的精子人工授精,并用PCR技术检测不同发育阶段的后代是否携带有外源DNA。结果表明,蜜蜂精子能将外源线性质粒DNA携带进入卵子。外源DNA能在受体蜜蜂个体中存在数月之久,能在幼虫期进行表达,且至少能稳定遗传3代。尽管没有找到外源DNA整合到蜜蜂基因组上的证据,但该研究证明蜜蜂精子同样具有携带外源DNA进入卵子的能力。这一阶段性成果不仅对于蜜蜂转基因有重大意义,对于那些可进行人工授精的昆虫转基因研究也有很大的借鉴作用。Takekazu和Takeo使用电穿孔法对成年蜜蜂大脑活体转基因进行了研究,初步建立了蜜蜂电穿孔法转基因体系。RT-PCR和免疫印迹分析分别从转录水平和翻译水平上证明了携带有绿色荧光蛋白基因的质粒在蜜蜂大脑中的表达。实验表明,脉冲电压为10~90V时能观测到外源基因在蜜蜂大脑的表达,且在这一范围内随电压的增大,蜜蜂成活率降低,基因转入率升高。例如,电压为50V时,成活率和基因转入率分别为55%和58%;电压为60V时,成活率则降为30%,基因转入率则升为92%。基于此,作者认为50~60V是蜜蜂电穿孔法转基因的最佳电压。另外,结果显示,外源基因在电极附近转化效率较高,因此可以根据需要选择电极位置,选择性地对某个特定区域或组织进行转基因。该研究所建立的体系将促进与蜜蜂大脑有关的行为、记忆等方面的研究,特别是有利于研究与大脑有关的基因的功能,及其基因网络。与其它蜜蜂转基因技术相比,该方法具有简单、快速、直接的优点。但由于该方法针对成年蜂特定组织进行转基因,因此所得到的转基因个体很难将性状稳定遗传给下一代。2关于讨论和提案2.1蜜蜂基因研究在昆虫领域中,除经典模式动物黑尾果蝇Drosophilamelanogaster(Meigen)之外,家蚕Bombyxmori(L.)转基因也已有较深入研究,包括显微注射法、精子载体法、电穿孔法、基因枪导入法等转基因技术在构建家蚕生物反应器和改进家蚕吐丝性状等方面已有应用。蜜蜂与家蚕相比,同为有着悠久饲养历史的经济类昆虫和在基础理论研究方面有重要应用价值的模式昆虫。但蜜蜂转基因研究明显落后于家蚕转基因研究。究其原因,除蜂学基础研究比较落后,蜜蜂转基因意义尚未得到足够认识之外,也源于蜜蜂社会性属性带来的特殊性。2.1.1生殖蜂群的饲养蜜蜂蜂群由蜂王、工蜂、雄蜂三型蜂组成,群内个体间分工协作,各司其职。蜂王专职产卵,雄蜂只负责在繁殖季节与处女王交配,工蜂则负责幼虫哺育、巢房卫生、安全警戒、食物采集、筑造巢脾等除产卵和交配之外的所有事务。也就是说,蜂王产下的卵在蜂群中是在工蜂(哺育蜂)的照料下孵化发育的。哺育蜂有清洁巢房行为,在查看巢房时,会清理或破坏掉那些带有异常气味、受损伤或发育不正常的卵和幼虫。而对卵或幼虫进行操作的转基因过程(如显微注射、扎刺法、电击法等)势必会使卵或幼虫受到一定的损伤,如果把转基因操作之后的卵或幼虫放回蜂群哺育,就很有可能被哺育蜂当作异常卵或幼虫而清理掉,使得转基因成功率变得更低。2.1.2遗传信息的传递蜜蜂群体中存在级型分化现象,具备相同遗传信息的受精卵孵化后在不同的条件下可以发育成具备完全产卵力的蜂王,也可以发育成生殖器官发育不完全的工蜂。如果转基因个体发育成工蜂,那么整合到蜜蜂基因组上的转基因遗传信息只能通过工蜂产未受精卵,未受精卵发育成雄蜂,雄蜂再与蜂王交配的途径传递给后代。游离于基因组之外的遗传信息则最多只能传递到转基因个体工蜂的子代雄蜂。因此,针对于卵或幼虫的蜜蜂转基因面对的又一个特殊的问题是,如何使得转基因操作后的卵或幼虫发育成有完全产卵力的个体(蜂王),而将转基因遗传信息稳定地遗传给后代。2.2蜜蜂转世的方法鉴于蜜蜂的以上2个生物学特性,我们认为,以下2种方法是蜜蜂转基因较好的途径。2.2.1精子诱导基因突变精子有瞬间吸收外源DNA的能力,可以作为外源基因的载体,在受精过程中将外源基因导入动物胚胎,从而使外源基因进入子代基因组中。这一方法因其操作简便、成本低廉、便于大量筛选等优点而受到人们的重视。至今,从低等的海胆纲动物到高等的哺乳动物如鼠类、牛、甚至人的各种实验表明,精子确实具备与外源DNA结合并将其整合到自己的基因组中的能力。精子介导转基因技术配套以蜜蜂人工授精技术是蜜蜂转基因比较好的途径。自1927年美国的Watson用他自己发明的装置,首次成功实施蜂王人工授精,在蜜蜂的控制交配上实现了第一个大的突破以来,该项技术已日臻成熟。人工授精技术的进步和人工授精仪的更新使得蜜蜂人工授精更易于掌握和操作,如今,蜂王人工授精的成功率已经很高,蜂王产卵性能可与自然交尾的蜂王相媲美。蜜蜂人工授精技术的成熟为蜜蜂精子介导转基因奠定了基础。Robinson等的研究确认了在人工授精技术成熟的条件下进行蜜蜂精子介导转基因的可行性。该方法操作简便、成功率高、成本低廉、便于大量筛选,是未来蜜蜂转基因的首选技术。但是,外源DNA贮藏在蜂王的贮精囊内面临着被降解的危险,因此在应用该法时就要求人工授精后的蜂王在尽量短的时间内开始产卵,以减小外源DNA的降解率,提高转基因成功率。2.2.2人工孵育条件与蜜蜂卵前孵化的关系针对于蜜蜂卵或幼虫的转基因操作势必会在卵或幼虫表面留下不同的气味甚至对其造成损伤,哺育蜂的清巢行为使得转基因操作之后的卵或幼虫在自然条件下孵化率或发育率更低,降低转基因成功率。那能否配套以成熟的人工孵育技术,将转基因操作之后的卵或幼虫在蜂群外孵育?根据周冰峰等对巢温范围内温度(32~36℃)对蜜蜂受精卵和蜂王封盖期发育的研究,从工蜂巢房内取出的蜜蜂卵在32~36℃,湿度控制在(70±5)%的人工气候箱中的孵化率可达到90.0%~97.22%,育王群中取出的封盖王台在32~36℃的人工气候箱中羽化率可达到93.94%~100%,蜂王初生重为226.7~228.5mg。周斌等进一步对意大利蜂受精卵人工孵化条件作了研究,并观察了人工孵化条件对受精卵各阶段历期的影响。结果表明,相对湿度是影响蜜蜂卵孵化率的又一关键因素,相同温度(34.0,34.5,35.0℃)下,相对湿度在(72±2)%和(44±2)%条件下孵化率差异极显著,而且胚胎死亡主要出现在发育早期和发育成熟期和后期之间这2个时期。Milne等将显微注射后的卵置于35℃的保温箱中孵化,孵化率也可达到21%,但孵化所需时间偏长。但是转基因操作是否会影响幼虫正常发育尚且不知。迄今为止,尽管在人工孵育条件下受精卵能正常孵化,王台中的王蛹也能正常羽化,但尚未有在人工孵育条件下受精卵能发育成正