大熊猫精子功能状态评定

大熊猫精子功能状态评定

人工技能和技术对拯救危机因素非常重要。大熊猫繁殖期存在配种难的问题,从20世纪60年代起人工授精作为辅助生殖技术引入大熊猫繁殖中,从而解决了这一难题。起初人工授精成功率极其低下,曾数年人工授精却没有产下一仔,从而引起研究人员对精液质量的关注。对大熊猫精液质量的评估,包括精液的常规检查,如精液量、精子密度、精子运动力和形态等方面。随着精子检测技术的快速发展,对精子质量检测的内容也进一步拓展,从常规检查发展到精子生化、免疫等方面的检测,染色技术也从普通损伤性染色发展到活体染色,从精子整体染色发展到顶体染色和DNA染色技术,从精子超微结构的检测发展到功能的检测,这些新技术已在哺乳动物精子质量检测中得到广泛的运用。但这些新技术的运用往往需要昂贵的仪器设备,因此,在大熊猫人工授精中运用较少。本文就目前人工圈养条件下,对大熊猫精液进行质量评估的内容及方法进行阐述。1进行精子密度测定的设备人工授精前须对大熊猫精液的体积、密度进行评估。精液体积直接采用微量移液器测定,对大熊猫精子形态的评价可采用光学显微镜直接观察,这两项评估都简单易行,不需特殊的设备。精子密度的测定采用血细胞计数板,在光学显微镜下直接计数,这种方法是一般实验室常用的方法,但精确度不高。条件较好的实验室可采用计算机辅助精子分析仪(computer-assistedspermanalysis,CASA)、流式细胞仪(flowcytometry)等设备,这是在光学技术的基础上结合计算机图像识别、运动图像处理技术发展起来的精子运动能力的综合分析方法。这种检测方法提高了检测结果的客观性、准确性,并且快速。2精子活力的变化对精子活力的评估是提高人工授精成功率的有力措施。精子活力是指有向前运动能力的精子百分率。只有前向运动的精子才有可能到达受精的位置,如果精子的活力过低,能够成功到达受精部位的精子数量势必受到影响。有研究表明,在人类宫腔内注射的前向运动精子总数≤20×106时,妊娠率明显降低。国外对其他动物的研究也表明精子的活力与受精率之间存在显著关系。在普通实验室,精子活力一般情况下采用在普通光学显微镜下直接观察记录。这种活力的评定方法易受主观因素的影响,带有一定的人为误差,但操作简便快捷,在实际工作中十分适用。在有条件的实验室,精子的活力也可采用CASA、精子质量分析仪(spermqualityanalyzer,SQA)来分析。3不同染色方法对精子顶体的影响顶体评估也是人工授精前精子质量检查的重要内容。顶体位于精子前端,是环绕头部的一个帽状结构,把精子头部分为顶体部和顶体后部,大熊猫顶体内有很多水解酶,包括受精过程必须的透明质酸酶和顶体素。在受精之前,具有完整顶体的精子是受精成功与否的关键。如果精子的顶体脱落、破损,顶体中的酶类丢失,受精过程就不能进行。因此,对顶体完整性的检测是人工授精前的一项重要工作。考马斯亮蓝染色、孟加拉玫瑰红/固绿染色法(Rosebengal/fastgreenstain,POPE)、巴氏染色、瑞-吉染色等是用于评价精子顶体完整性的简单染色方法,直接染色后就可以在光学显微镜下观察。考马斯亮蓝染色约需35min,染色过程简单,可以明确区分精子的头部、中段和尾部。但由于其染料单一,有时可将精子顶体区与顶体后区均染成蓝紫色,影响精子顶体和形态的判读。POPE染色用时约3min,过程也很简单,将精子顶体染成深紫色,顶体丢失后精子头部呈白色,顶体受损的也是深紫,但顶部表面凹凸不平,呈锯齿状。该法易受时间温度影响,导致精子头部着色过深,难以判断顶体受损程度。改良巴氏染色用时约40min,染色步骤多,染色后精子头部顶体区呈蓝色,顶体后区呈深蓝色,中段可呈淡红色,尾部染成蓝色,能清晰呈现精子各部分形态,适于精子形态学分析,但是它不能对顶体区提供可靠对照。瑞-吉染色需15min,染色过程并不复杂,但染料需新鲜配制,且磷酸缓冲液的pH会影响染色效果,染色时间易受温度影响。瑞-吉染色能清晰染色顶体外膜,容易区分顶体,适于顶体完整率判读。4顶体囊泡化与精子成活率的关系精子膜的完整性是影响大熊猫人工授精成功率的又一重要影响因素。这里包括两方面原因,一方面,精子质膜完整性是其死活的一个间接指标。另一方面,精子顶体膜的完整性也是精子能够发生顶体反应的基本要求。大熊猫精子顶体膜为双层结构,发生顶体反应时顶体囊泡化主要是由顶体双层外膜分散性的自我融合而成。如果顶体质膜破裂则无法完成顶体反应。对于精子死活的鉴定则可采用常规染色方法,伊红染色、伊红-苯胺黑(eosin-nigrosinstain)和台盼蓝(typanbluestain)染色是最常用的活体常规染色技术。这些染色法在大熊猫精子成活率评估中具有重要作用。但在染色过程中,均会对精子造成损伤,使得成成活率低于实际情况。对于精子质膜完整性的评估,还可以采用低渗肿胀实验(hypoosmoticswellingtest,HOST)。精子质膜能够有选择地运输水分子,当质膜完整的精子被放到低渗溶液中时,水会进入精子内部使精子体积增大、顶体肿胀、尾部弯曲,尤其以尾部弯曲这一特征比较明显,因此可以用弯尾率作为评价精子质膜完整性的标志。5精子穿透试验对精子受精能力的检测更能准确地评价精子获能、顶体反应和核去致密化,以及受精后胚胎的发育能力。由于卵子周围被透明带包围,所以透明带是体内受精的第一个屏障。精子穿入透明带的能力检测也是一种估计精子受精能力的分析方法。该方法主要利用去透明带仓鼠卵或同源动物卵的穿透试验来分析。由于大熊猫是珍稀动物,且其卵不易获得,因此采用异种卵来检测精子受精能力就十分适用。去透明带地鼠卵穿透试验就是检测大熊猫精子受精能力的常用方法,这种方法的优点是可以避开取大熊猫卵的难题,缺点是检测过程过于复杂,难以快速完成,并且与体内实际受精能力有所差别。6建立、完善的精子检测检测设备利用体外方法准确评价精子的受精能力和功能状态是人工输精技术成功的关键,还可以减少每次输精的精子量,达到最合理利用优良遗传资源的目的。大熊猫人工授精精液体积及密度、活力、顶体染色、低渗肿胀实验等检测技术都具有简单、易行和可靠等特点,在精液品质评价中具有很高的应用价值。但这些方法技术都有一定的人为主观因素导致的误差,检测的结果精确性与检测员的技术、经验等有密切关系。随着精子检测技术的快速发展,一些新的精子检测技术将引入到大熊猫人工授精中来,使这些人为误差逐步减少,例如,采用荧光探针染色技术检测精子的成活率、顶体、质膜等,也可采用flowcytometry、CASA、SQA等设备,建立标准,减少误差。这些设备的应用是大熊猫精子质量评估领域发展的必然趋势。但这些高科技设备在实际工作中的应用,一方面需要进一步提高实验室条件,增强对硬件设施的建设,提高检测人员的技术水平;另一方面要建立统一的检