牛胚胎移植技术的研究进展

牛胚胎移植技术的研究进展

胚胎移植（et）是指从同一异质母牛的原始胚胎中移植到同一生理状态的母牛，并继续发展为一个新个体。此项技术对提高优秀母畜的繁殖力、加快遗传进展、增加肉用畜种的双胎率、克服母畜不孕症、降低引种费用、减少疾病传播等方面均具有重要价值。本文就牛胚胎移植技术的研究和应用现状做一综述。1牛胚胎移植技术的发展1.1牛胚胎的研发胚胎移植在兔上首次试验成功(Heape,1890),距今已有110多年的研究发展历史。1951,Willett首次成功地进行了牛的胚胎移植。20世纪60年代,英、法、加、美、日等国对牛胚胎移植的技术环节进行了大量研究。1975年1月在美国科罗拉多州召开了第一届国际胚胎移植学会成立大会。1976年牛的非手术法胚胎移植成功,1977年开始进入商业化应用,13个国家成立了数百家商业性的胚胎移植公司。据统计,1978年后仅北美地区每年生产近10万头胚胎移植犊牛,其中奶牛占30%。截止1990年,美国登记的胚胎移植荷斯坦奶牛总量已达到142598头,美国荷斯坦奶牛核心群母牛的27.5%和优秀种公牛的44%来自胚胎移植产生的后代。日本的荒本兽医科诊所于1986～1992年在熊本县菊池郡管区对85户农民饲养的6000头奶牛进行了胚胎移植研究,受胎率59%,获得1980头移植犊牛。到1986年,加拿大登记应用胚胎移植获得的犊牛达18079头,其中一头最优秀的母牛已生产了86头胚胎移植小牛,拥有18头以上不同的后裔,同时还有8头自然出生的小牛。在欧洲牛冷冻胚胎的使用率达47.8%。牛胚胎移植的增长速度非常快,1991年全世界移植受体240730头,到1996年增加到412573头。目前,据不完全统计全世界年产胚胎移植牛超过了35万头。1.2奶牛胚胎移植情况我国牛胚胎移植技术的研究和应用起步较晚。1978年,中科院遗传研究所和上海市牛奶公司用手术法得到了第一头胚胎移植犊牛。1980年采用非手术移植法获得了胚胎移植犊牛。在20世纪80年代中期以前,我国牛胚胎移植处于试验研究阶段。此阶段试验头数少,水平低,以鲜胚移植为主。据报道,芦台农场奶牛实验站等11个单位于1983～1984年间共超排奶牛329头,头均获胚胎2.9枚,其中可用胚胎1.5枚。鲜胚移植受体160头,妊娠38头,移植妊娠率为23.8%。同时多个单位还开展了冷冻胚胎的研究,共移植29头受体,妊娠5头,移植妊娠率仅为17.2%。20世纪80年代中期至90年代中期,我国牛胚胎移植技术进入发展提高阶段。这时开展此项研究的单位增多、群体规模增大,水平有所提高,冷冻胚胎比例增大。据统计,1986～1988年期间,芦台农场奶牛实验站等单位共超排奶牛1501头次,头均获胚胎5.6枚,可用胚胎3.6枚;新鲜胚胎移植妊娠率为39.4%,冷冻胚胎移植妊娠率为21.5%,冻胚移植比例为37.2%。据陈静波、郭志勤等(1995)报道,新疆家畜生物工程实验中心1991～1994年共超排402头次,获可用胚胎2024枚,头均5.04枚;鲜胚移植1040头,产犊519头,产犊率49.9%,冻胚移植173头,产犊45头,产犊率26.0%。20世纪90年代中期后,我国牛胚胎移植技术进入推广应用阶段,并逐步向产业化阶段迈进。中国农科院畜牧研究所罗应荣、朱化彬等(2001)报道,1996～2000年,北京奶牛中心和黑龙江畜牧研究所共超排奶牛857头次,获可用胚胎5067枚,头均5.91枚,移植受体2123头,移植妊娠率51.76%。郭志勤等(2001)报道,1998～2001年间,新疆处理供体牛806头,获可用胚胎4743枚,平均5.88枚;鲜胚移植受体牛501头,妊娠311头,妊娠率62.08%;冻胚移植2820头,妊娠1413头,受胎率50.11%。桑润滋(2000)报道,河北、山东、河南1996～1997年从国外引进西门塔尔、利木赞、夏洛来等肉牛冻胚,移植受体600头,妊娠241头,移植妊娠率40%。本世纪初,我国胚胎移植技术得到了很快的发展。为加快奶牛胚胎移植产业化进程,2002年初农业部实施了“万枚高产奶牛胚胎移植富民工程”项目,在内蒙古、新疆、北京、陕西、山西、河北、山东七省市广泛开展了奶牛胚胎移植的大规模示范推广,取得了显著效果。“十五”期间国家投资1.5亿元,在河北、北京、上海、黑龙江、内蒙古等省、(市)实施的“奶业重大关键技术研究与产业化技术集成示范”项目,明确规定利用胚胎移植技术培育高产核心牛群数万头。目前,我国已有20多个省市开展了家畜胚胎移植及相关生物技术的研究与推广工作,且有进一步扩大的趋势。2牛胚胎移植的技术方法和注意事项2.1期外看,以供体牛和受体的正常发情周期为依托,增加日粮,保证引食期及日粮在体的安全和病毒的补充,是论证超排、变更来确定的依据供体要符合品种标准,具有优良生产性能和育种价值,没有遗传疾病,繁殖机能旺盛,体质健壮,年龄3～8岁,膘情适中。产后6～9周的母牛不宜做供体,同一头牛在一个泌乳期内不宜做两次以上超排处理。超排前供体牛血清孕酮含量3.0ng/mL或以上,总胆固醇含量140ng/100mL以上,可作为选择供体牛的参考指标。据统计,按上述标准严格选择供体牛,可获得超排率80%以上。受体要选体格较大,膘情好,繁殖机能正常的适繁健康母牛。根据供、受体牛群的营养状况,在超排前30～45d开始调整日粮,增加日粮中青绿饲料、维生素和微量元素的补充。供、受体牛群至少要连续观察两个正常发情周期,才能保证超排、同期发情和受胎效果。供受体牛比例一般为1:6～8。2.2超排剂量的确定牛的超排处理一般采用FSH减量注射法。即在供体牛发情后的9～13d(查黄体)肌注FSH,早晚各一次,间隔12h,分4d减量注射。在第3d时同时肌注PGF2α4mg。超排剂量应根据激素的国别、厂家和供体大小确定,国产FSH一般为320～360u,进口一般为28～36mg。超排处理前的母牛可采用孕激素作预处理来提高母畜对促性腺激素的敏感性,增强超排效果。2.3牛肉的接受、检查、不动通常要求从肌注PGF2α第2d傍晚开始观察母牛发情情况,至少早晚各观察一次,以母牛接受爬跨、站立不动为主要判定标准。在观察到供体牛稳定接受爬跨后4～6h进行第一次输精,输精间隔为10h～12h,输精次数3次左右为宜,每次输入符合国家标准的冷冻精液至少2个剂量。2.4含量、发酵时间及管道一般采用两次前列腺素注射法。在不知发情周期的情况下,间隔11d,两次肌注PGF2α。处理的日程安排应与供体牛超排处理相吻合。应根据母牛接受爬跨的情况观察发情,早、晚各30min。对发情牛需做直检以确认卵泡发育状态,次日上午或晚上确定是否排卵,在发情36h以后排卵的牛一般不能作受体。实际移植时,可按胚胎发育情况选受体牛的发情日差,可将致密桑椹胚移植给发情6d的受体牛,将早期囊胚移植给发情7d的受体牛,将囊胚和扩大囊胚移植给发情8d的受体牛。2.5胚胎收集2.5.1确定受体头数以发情日为第0d,在第5～6d检查卵巢确定黄体数,以便安排受体头数。第7d(或第6～8d)回收卵。术前应断水绝食24h,以减小腹压和瘤胃的压力。2.5.2吊瓶和灌流对测定灭菌处理过的冲卵管用PBS液冲洗2～3次,插入钢芯,检查气球。在无菌间用导管连接吊瓶和集卵杯灌流装置。装入PBS液的吊瓶在37℃水浴中预温待用。准备好必要的麻醉剂、注射器、酒精棉和冲洗消毒剂等。2.5.3牛保定和麻醉供体牛保定完毕后,在第一、二尾椎骨间酒精消毒,用2%普鲁卡因3～5mL作硬膜外麻醉或肌注2%静松灵1mL。2.5.4粪便的消毒麻醉后将牛尾竖直绑在保定架上,清除粪便,用清水冲洗会阴部,再用高锰酸钾液冲洗消毒,用灭菌卫生纸擦干,最后用酒精棉球消毒,生理棉球擦洗。2.5.5诱导冲卵管入引助手将准备好的冲卵管交给术者,术者用一手食指和拇指扒开阴门插入冲卵管,再将另一手伸入直肠,仔细小心地诱导冲卵管经子宫颈进入一侧子宫角至大弯处,抽出少许钢芯,再将冲卵管向前推,使其尖端靠近子宫角深部。由助手持30mL注射器一次推入空气,一般青年牛充气14～16mL,经产牛为18～25mL。冲卵管固定后抽出钢芯,开始灌流。2.5.6单位面积20%术者左手通过直肠辅助按摩子宫角。每次灌注30～50mL,由少到多,每侧子宫角冲8～10次,每侧总量为300～500mL,回收后注入加盖量筒。全过程需在室温(25℃左右)操作。2.5.7术后处理两侧子宫角冲卵完成后,放出一部分空气,将冲卵管抽至子宫体灌注80万单位青霉素和100万单位链霉素,拔出冲卵管。2.6观察胚胎形态和发育状况捡胚室的温度要维持在25℃左右。捡胚时,先将回收液用集卵杯过滤,把剩余液体分批到入平皿中,用拣卵针拨开异物,将所有胚胎吸入新鲜的保存液中,再用新鲜的保存液洗涤2～3次,然后置于100～200倍体视显微镜下,观察胚胎形态和发育状况。若卵子卵黄未形成卵裂球,则为未受精卵。A级胚胎:呈球形,轮廓清晰,卵裂球大小均匀,胚内细胞结构紧凑,色调和透明度适中,无附着的细胞和液泡;B级胚胎:轮廓清晰,色调和细胞密度良好,有少量附着的细胞和液泡,变性细胞占10%～30%;C级胚胎:轮廓不清,色调暗,结构松散,游离的细胞和液泡较多,变性细胞占30%～50%。A、B、C级胚胎可用于鲜胚移植,A、B级胚胎可用于冷冻;其它胚胎和未受精卵一并弃去。操作时应避免损伤胚胎。2.7胎盘移植牛胚胎移植常用非手术法。2.7.1两组患者发发发发发发时两组见表1要求受体牛发情直检时卵泡直径在10～20mm左右,发情后36h内出现排卵。移植前一天直检黄体,其直径在11～15mm以上,黄体的手感弹性好,质地软而充实。2.7.2移植枪的消毒用金属移植器,需先将移植枪、枪头及金属保护外套分别用纸包扎好,高压消毒。塑料卡苏式移植枪需经气体灭菌。移植时,先用75%酒精棉球消毒装有胚胎的塑料吸管,然后剪掉封口一端,装入移植枪内,套上保护外套。2.7.3安装管道可用0.25mL细管分三段吸入PBS保存液,中间由两个气泡隔开,中段含有胚胎。2.7.4普鲁卡因dml有5l的尾腰椎间硬膜外麻醉将受体牛保定,肌注2%静松灵1mL或用2%的普鲁卡因3mL在1、2尾椎间硬膜外麻醉。清洗外阴,用高锰酸钾水消毒,用灭菌纸擦干,最后用酒精棉球消毒,生理棉球擦洗。2.7.5大可插之岩,开应当去宫口术者用一手扒开外阴,另一手持移植器插入阴道。然后左手伸进直肠,移植枪到达子宫颈口时,右手用力将移植枪捅破外套,插入子宫颈。左手在直肠内诱导使枪头轻轻稳妥地插入黄体侧子宫角至大弯处,持移植器的右手推出胚胎,缓慢旋转地抽出移植枪。2.8供体的折返时间胚胎移植后,应密切观察供、受体术后的健康情况,并留意它们在预定的时间内是否会返情。供体在第二次发情时即可照常配种,或经过2～3个月后可重复做供体。受体母牛移植后要进行妊娠诊断,确认妊娠的母牛,要加强饲养管理,防止流产。3牛胚胎移植的问题和发展趋势3.1牛胚胎移植的问题成本高、效率低、无明确的组织机构、技术人员缺乏、高产牛比例低等弊端是目前我国牛胚胎移植的推广应用中存在的主要问题。3.2牛胚胎移植的现状胚胎移植技术有