植物与微生物的相互作用

植物与微生物的相互作用一、共生菌与病原菌的应用1.1利用工程化的共生菌保护植物免受冻害

定植于植物叶面的丁香假单胞菌在细胞表面产生一种冰成核蛋白（icenucleationprotein），在稍低于0℃以下的条件下，这种蛋白引起结冰，使作物遭受冻害，StevenLindow及其研究小组利用DNA重组技术及同源重组技术得到Ice-突变株，使结冰温度下降到-9℃。1.2利用固氮菌提高作物产量化学固氮转化条件苛刻：温度高于500℃，压力大于200atm。大量施入田间的肥料流失，最终流入海洋，导致水体严重污染以及水中微藻及其它微生物大量繁殖。生物固氮无需消耗燃料或电等能源，不造成污染，过程复杂，需要酶（固氮酶和固氮酶的还原酶）的参与，消耗大量ATP，需要严格无氧的微环境。二、农杆菌介导的植物转基因方法植物转基因方法分为两类：一是直接基因转移方法:基因枪法、PEG介导的原生质体法、花粉管通道法、电激转化法等，其中基因枪转化法是代表。二是生物介导的转化方法，主要有农杆菌介导和病毒介导两种转化方法，其中农杆菌介导的转化方法操作简便、成本低、转化率高，广泛应用于双子叶植物的遗传转化。基因枪法优点：不受物种的限制只要构建基因表达盒（启动子-基因-终止子），不需要构建在表达载体上没有农杆菌污染可以快速知道基因表达（瞬时表达，研究启动子功能）缺点：1价格贵2基因往往多拷贝插入原生质体转基因优点：不受物种的限制只要构建基因表达盒，不需要构建在表达载体上没有农杆菌污染可以研究基因瞬时表达缺点：操作比较麻烦、难度大（原生质体制备、转化、再生）ProtoplasttransformationoftransgenicValenciasweetorangeplantswithGFPbyPEG-mediation一、农杆菌介导的（Agrobacterium-mediated）转基因机理土壤农杆菌（Agrobacterium

tumefaciens）是一种革兰氏阴性土壤杆菌，在自然界中普遍存在，其特点是能感染双子叶植物，并引起植物形成肿瘤。天然的植物遗传工程土壤农杆菌的基因组与Ti质粒组成原因：土壤农杆菌中Ti质粒上一段DNA（T-DNA，transferDNA，编码生物碱和植物激素）转到了植物细胞基因组中，引起植物细胞旺盛分裂。（一）Ti质粒的结构毒性区肿瘤区冠瘿碱代谢区复制区

Ti质粒大约在160-240kb之间。其中T-DNA大约在15kb-30kb。Vir基因区在36kb左右。除此之外，Ti质粒上还存在Con区（regionencodingconjugation)和ori区（originofreplication)。auxA

auxB

cyt

ocsLBRBLB,RB–leftandrightborders(directrepeat)auxA+auxB–enzymesthatproduceauxincyt–enzymethatproducescytokininOcs–octopine

synthase,producesoctopine

1.T-DNA的结构

T-DNA上共有三套基因和左右两个边界。左边界（leftborder）和右边界（rightborder）：是长为25bp的末端重复顺序，在切除及整合过程具有重要意义。生长素合成酶基因（tms）：由2个基因组成：tms1（iaaM）和tms2（iaaH）；细胞分裂素合成酶基因tmr：由1个基因组成：ipt

冠瘿碱合成酶基因tmt：冠瘿碱是含稀有氨基酸衍生物，称为opines，冠瘿碱有四种类型：章鱼碱（octopine）、胭脂碱（nopaline）、农杆碱（agropine）、琥珀碱（succinamopine）。被感染的植物诱导合成这些有机碱，但植物不能利用它们，其分解酶基因在Ti质粒上，分解产物为氨基酸和糖类，供根癌农杆菌作为氮源及碳源使用。根据冠瘿碱不同，Tiplasmids可以为几种：1)胭脂碱型（Nopalineplasmids）:带有在植物中合成胭脂碱的基因和在细菌中代谢、利用胭脂碱的基因。形成的肿瘤可以分化出不定芽。Nos启动子，Nos终止子。2)章鱼碱（Octopineplasmids）:带有在植物中合成章鱼碱的基因和在细菌中代谢、利用章鱼碱的基因。形成的肿瘤不能分化，成为愈伤组织。3)农杆碱型（Agropineplasmids）:带有在植物中合成农杆碱的基因和在细菌中代谢、利用农杆碱的基因。形成的肿瘤不分化，生长迟缓，死亡早。4)发根型（Riplasmids）:诱导毛状根或者肿瘤。2.Vir(virulent)genes（毒性基因区，致病基因区About30kb;virA,B,C,D,E,F,G(A-Eareoperonswith multipleORFs)；受到受伤植物细胞释放的Acetosyringone

(AS，乙酰丁香酮)

激活；把Ti-质粒或者Ri-质粒的T-DNA转移到植物细胞基因组中（转基因）。virA

-transportsASintobacterium,activates virG；virG

-promotestranscriptionofothervirgenes；virD2-endonucleasethatcutsT-DNAatthe bordersbutonlyononestrand;attachesto the5‘endoftheSSofT-DNA；virE2-DNA-bindingprotein,bindsSSofT- DNA；virD2&virE2alsohelpT-DNAgettonucleusinplantcell,theyhaveNLSs(核定位信号)；virB

-11ORFs,helpsDNA-proteincomplex getthroughcellmembranes。（二）T-DNA的整合机制

T-DNA的详细整合机制尚不完全清楚，明确的：农杆菌染色体上的基因（chvA,chvB,pscA等）决定与植物细胞的附着；植物损伤部位分泌出酚类物质乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮，这些酚类物质可以诱导Ti质粒上Vir（Virulenceregion)基因的表达；Vir区编码的基因产物分别在LB和RB的第三个碱基和第四个碱基之间产生缺口，形成单链T-DNA，并将其运到植物细胞核中，整合到核基因组中。由特异性内切酶完成。T-DNA的LB和RB在整合中的作用是不对称的，RB顺序与整合有关，而LB无关。T-DNA的整合可以是单拷贝的，也可以是多拷贝的，成串联形式排列。植物肿瘤二、植物基因表达载体天然的Ti质粒不能作为表达载体使用：

a.被转化的植物细胞产生大量的生长素和细胞分裂素，导致肿瘤的形成，阻止了细胞再生长为整株植物，因此，必须除去生长素和分裂素基因。

b.冠瘿碱的合成与T-DNA的转化无关，而且可能会影响植物细胞生长，因为冠瘿碱合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，因此必须去除冠瘿碱合成基因（tmt）

c.Ti质粒约为200kb，重组操作非常困难，也很难找到单一的酶切位点。

d.Ti质粒不能在大肠杆菌中复制，为了使重组质粒DNA的大量扩增，须添加入大肠杆菌复制子。植物细胞中一般不存在质粒，为利用农杆菌的Ti质粒，发展了共整合系统和双元载体系统，避免了在大的Ti质粒上进行分子重组操作的困难。1.植物细胞转化的共整合系统

T-DNA克隆在大肠杆菌质粒上，含有E.coli的选择标记和植物选择标记Kan+。首先在E.coli中筛选重组分子，然后将重组质粒转化到农杆菌中，质粒与Ti质粒上的同源序列发生同源重组，将外源基因整合到Ti质粒上，用于侵染植物细胞。T-DNA重组分子整合到植物细胞染色体DNA上，Kan+筛选转化细胞。共整合载体

大肠杆菌质粒农杆菌Ti质粒重组农杆菌Ti质粒2.植物细胞转化的双元系统

目前T-DNA转化植物细胞的标准方法是双元系统，即穿梭质粒。插入外源基因的重组穿梭质粒直接转化含有Ti质粒的农杆菌，经筛选后直接感染植物细胞。与共整合系统所不同的是，含外源基因的质粒可在农杆菌内自主复制并保留下来。农杆菌侵染植物细胞后，植物的创伤信号启动Ti质粒上的Vir基因，随后将穿梭质粒的T-DNA切割下来，转移到植物细胞中。双元载体系统目的基因表达盒tgacaggatatattggcgggtaaacRBtggcaggatatattgtggtgtaaacaLB多克隆位点报告基因植物筛选基因Kpn

IXba

I启动子基因终止子三、农杆菌介导的转基因步骤农杆菌准备：单菌落、试管中培养，再在三角瓶中放大培养（1：30-50稀释）至OD600=0.5-1。在培养结束前1h加20-100μMAS可以促进农杆菌的转化。4000-5000rpm/4℃离心收集，再用植物培养基悬浮，备用。植物材料的准备：要求生长健壮、再生能力强、无菌；切成小片（小段）。感染：将农杆菌液与植物材料混合，浸润10-30min。共培养：植物材料在无菌吸水纸上吸干农杆菌液后，转到共培养基上（共培养基常常含有AS），培养2天，转基因在此时间内完成。筛选与再生：共培养结束后的植物材料转到选择与再生培养基上（含2种抗生素，分别抑制农杆菌和非转基因植物细胞生长）。转基因植物的鉴定与评价：报告基因、PCR、Southernblot、Northernblot、产物分析等。图农杆菌转化植物细胞感染转化选择转基因植株评价与鉴定再生转基因植物的鉴定：（1）检测报告基因:GUS（编码葡萄糖苷酶）报告基因检测（GUS染色）GUS染色原理5-溴-4氯-3-吲哚葡萄糖苷，无色兰色分析启动子功能GFP:greenfluorescentprotein。是从维多利亚水母(Aequorea

victoria)中分离出来的，受紫外线激发而发出绿色荧光GFP基因（2）PCR检测植物基因组中外源DNA（目的基因、启动子）（可能有假阳性）（3）Southernblot直接检测植物基因组中外源DNA（目的基因、启动子）鉴定转基因最直接的证据。发表文章时必须提供该证据基因组DNA、酶切、电泳、转移DNA到杂交膜、与探针杂交、洗脱、检测（放射法、化学法）、照相（4）检测外源基因的转录和表达产物

RT-PCR

WesternBlot基因表达载体的构建：目的基因和启动子的选择与获得、表达载体的构建（DNA重组）与确认。基因工程菌的获得：将基因表达载体导入农杆菌中，并选出含有基因表达载体的菌落。建立被改良植物的高效再生体系：不定芽再生体系、胚状体再生体系、原球茎再生体系（兰花）。确定植物材料对抗生素（潮霉素、卡那霉素）的敏感浓度：临界敏感浓度转基因效率的提高方法：四、怎样建立植物转基因技术实例:火焰卫矛（Euonymusalata

）转基因技术研究秋天，绿叶转红，形成霜叶红于二月花的景象

140年:广为栽培、选育新品种；重要的园艺观赏植物，年产值2-3亿美元。问题：结实旺盛，扩散到野外繁殖、形成优势种群，抑制本地植物生长、破坏生物多样性。方法：禁止种植（问带来题：无替代植物，影响公司产业、影响就业）培育无籽品种：好(1)研究植株再生技术不定芽的诱导最佳条件研究生根最佳条件研究(2)选择抗性试验(3)构建“超级不育”表达载体pAB5启动子花粉与胚囊特异Barnase基因RNA酶Agl5启动子子房特异iaaM基因合成生长素雌雄不育无籽结实无籽果实(4)转基因植株培育(5)转基因植株的鉴定转基因植株的报告基因（GUS）表达验证X-Gluc（无色）GUS

兰色Gusplus基因在原核生物中不表达五、影响转基因效率的因素什么是转基因效率？愈伤组织水平：转基因效率=芽的水平：转基因效率=植株水平（最重要）转基因效率=转基因愈伤组织的总数感染的外植体总数X100%转基因芽的总数感染的外植体总数X100%转基因植株的总数感染的外植体总数X100%一个转基因方法好不好，可以用转基因效率衡量1.植物的再生方法与效率影响植物再生效率的因素必然影响转基因效率。植物的再