5种绵羊精液稀释液在常温条件下的缓释效果

5种绵羊精液稀释液在常温条件下的缓释效果

众所周知，精子质量是影响工艺精细效果的重要因素之一，而精细稀释溶液的制备对生津温度条件下的山羊精子质量有直接影响。依据稀释液组份不同，绵羊精液常温保存稀释液的配方有很多种。本试验通过对9种不同配方稀释液常温保存绵羊精液效果进行试验观察，最终筛选出效果较好的5种稀释液配方，并将其在常温条件下处理保存的绵羊精液用于适配母羊的人工授精，观测其不返情率，进一步比较在常温条件下用上述不同配方稀释液处理的绵羊精液的人工授精效果，旨在获得对绵羊精液稀释效果较好的常温保存绵羊精液稀释液配方，以便在广大农村推广使用。1试验材料和方法1.1小尾寒羊羊种本试验选取北京市大兴区四季兴养殖中心的成年种公羊（2～3岁）5只，其中小尾寒羊公羊3只，无角陶赛特公羊1只，蒙古羊公羊1只，供采精用。试验所用母羊也为该中心饲养，品种为小尾寒羊。选择达到适配年龄（2～3岁），经产的发情母羊作为人工授精的对象，共30只。1.2假阴道内的压力和采精2004年3月15日-2004年5月19日。首先，对人工授精使用的器械进行严格消毒。采精前公羊外阴部及周围用0.1%高锰酸钾溶液冲洗消毒，并用毛巾擦干。采精员身穿已消毒的工作服，洗净手臂并消毒。其次，应注意假阴道的正确使用。假阴道内的温度一般控制在38℃～40℃。假阴道内的压力可借助注水和吹入空气来调节，以假阴道内胎口处形成Y形，即呈现3个饱满的瓣状表示压力合适。其润滑度可用消毒的润滑剂（液体石蜡、凡士林）对假阴道内表面加以润滑，涂抹部位是假阴道全长的1/3～1/2处至开口外围。采精用的台畜一般为活畜，如发情母羊或去势公羊等。经过训练调教的公羊一到采精现场，不要急于让其爬跨台畜，应适当诱情，如绕台畜转几圈等，让公羊在采精前有充分的性准备，可提高采得精液的质量和数量。采精员位于台畜右侧，右手持假阴道与台畜平行，假阴道开口应和公羊阴茎伸出的方向倾斜度一致。在公羊爬跨台畜向前做“冲跃”动作时，采精员左手四指并拢握住包皮，将阴茎导入假阴道内。待射精完毕，立即将集精杯一端竖直向上，先放去假阴道内胎的空气，然后取下集精杯，送往精液处理室做精液品质检查。公羊的采精频率在配种季节每天采精1～2次，每周采精达5～10次。但每周应让其休息1～2d。1.4精子的密度和数量正常的精液应为白色或淡黄色，无味或略带腥味。凡呈红褐色、绿色并有臭味的精液不能用于输精,含有大块凝固物质的精液也不能使用。肉眼观看刚采集的精液应呈翻腾滚动的云雾状态。绵羊的射精量为0.5～2.0mL，一般为1mL左右。1mL绵羊精液中精子的数量约20～30亿左右。检查精子的密度，常用3级评定：密集的精子充满显微镜整个视野，精子之间几乎无空隙或空隙小于1个精子的长度，看不出单个精子活动情况的为“密”；精子间相互距离有1～2个精子的长度，能看清单个精子活动的为“中”；视野中只有少量精子，且相互距离很大的为“稀”。密度在中等以上的精液才能使用。1.5稀释液的稀释是采用液压法见图2。根据对于第1规定，把液配制到液最初收集到原始精液稀释液配方共9种（见表1）。经对绵羊精液稀释后观察其在常温下的保存效果（精子总存活时间和精子有效存活时间），从中筛选出较好的5种稀释液配方（见表2），并进行绵羊精液稀释保存后的母羊人工授精试验。稀释液制作方法与精液稀释比例如下：1号稀释液：精液稀释比例1∶4。2号稀释液：精液稀释比例1∶4,方法是：将新鲜鸡蛋的蛋清用滤纸吸净，除去卵黄膜，量取10mL卵黄与生理盐水混匀，再加入适量抑菌药物即可。3号稀释液：精液稀释比例1∶4，方法是：采集新鲜羊奶用7层纱布过滤2次，再将其煮沸10～15min，冷却至常温后去奶皮，再用生理盐水稀释混匀即可。4号稀释液：精液稀释比例1∶10，方法是：采集新鲜羊奶用7层纱布过滤2次，再将其煮沸10～15min，加入明胶搅拌至溶化混匀，冷却至常温后去奶皮，再加入抑菌药物即可。5号稀释液：精液稀释比例1∶4，方法是：在双蒸水中加入葡萄糖和柠檬酸钠，过滤2～3遍，蒸煮30min，降温至25℃，再加入新鲜卵黄和抑菌药物，降至室温即可。6号稀释液：精液稀释比例1∶10，方法是：将明胶加热至液态再与双蒸水混匀，加入抗菌药物即可。7号稀释液：精液稀释比例1∶4，方法是：将蜂蜜溶入水中，加入抗菌药即可。8号稀释液：精液稀释比例1∶4。9号稀释液：精液稀释比例1∶4。配制稀释液原则上是现用现配。如隔日使用和短期保存（3～5d），必须严格灭菌、密封，放在0℃～5℃冰箱中保存。但卵黄、抗生素等物质，必须在使用前添加。配制稀释液用水应为新鲜、无菌的蒸馏水或双蒸水。药品最好用分析纯，称量药品必须准确，充分溶解，过滤，消毒。精液采回后，在37℃等温条件下，按上述稀释比例做精液原液稀释，然后装入洗净的青霉素小瓶中编号标记。当精液稀释后自然降至室温时（约12℃～15℃左右），置于12℃～15℃恒温冰箱中保存。每隔2～4h翻动1次青霉素小瓶，以防止精液发生沉淀和发生精子凝集现象。1.7活动精子的保存时间刚开始精子活力较好时，每隔4h检查1次，随着精子活力下降到0.3以下后，1h镜检1次。即镜检时有活动精子的总计保存时间。即镜检时精子活力为0.3以上的保存时间。1.8输精量的确定绵羊在发情开始后10～36h内输精为宜。我们根据公羊试情情况，在母羊发情开始后早晚各输精1次。次日仍然发情的母羊，进行第3次输精。稀释精液的用量为0.20～0.30mL。精子活力为0.3以上。母羊的输精部位在子宫颈口或插入子宫颈1cm左右。1.9母羊无返情情况将我们筛选出的A、B、C、D、E共5种稀释液，随机采取公羊精液后在常温下进行稀释处理。稀释保存后的5种精液（活力在0.3以上）各随机用于6只发情待配母羊人工输精，共输精30只种母羊。人工输精（18～21d）后，观察记录母羊未返情个体。若未返情，则作为判断母羊已经妊娠的依据，通过未返情率推算母羊受胎率。人工授精后统计A、B、C、D、E5种稀释液处理的绵羊精液的人工输精母羊未返情母羊只数及未返情率，并将A、B、C、D、E5种稀释液处理的绵羊精液人工授精后母羊未返情率进行样本百分数差异显著性检验。2试验结果2.1稀释液的配方优化试验结果将原始9种稀释液随机分成3组，每种稀释液做4次羊精液稀释保存试验，羊精液稀释后常温保存精子存活时间为4次试验平均值，结果见表3。从表3可知2、3、5、7、8、9号等共6种稀释液配方效果较好。但是，考虑到所用药品的应用广泛性、成本、配制的繁锁性，我们剔除8、9号稀释液。又因为这次试验的主要目的是为广大的中小型企业选择适用的精液稀释液，所以我们考虑到养殖场人工投入、技术支持、设备成本的问题，保留了1号稀释液配方。2.2加入适量抑菌素类药物我们主要针对以上筛选出来的5种稀释液保存精液总存活时间较短问题，分别加入适量抑菌素类药物，进一步改进其保存精液能力，再重复上面的试验，并记录试验结果，见表4。我们可以从表4中看出，在我们改进了这5种原始配方后，其精液保存效果都有了一定的提高，从而反映出抑菌素的添加是很有必要的。2.3稀释液稀释使用试验结果将筛选出来的1、2、3、5、7号稀释液重新编号为A、B、C、D、E后，进行绵羊精液稀释保存和母羊人工授精试验，试验结果见表5。经过A、B、C、D、E5种稀释液配方稀释保存羊精液的人工授精母羊的观察，母羊未返情率分别为66.67%、83.33%、66.67%、83.33%、83.33%，人工授精效果较好。经未返情率的样本百分数差异显著性检验，5种稀释液配方稀释保存羊精液的人工授精母羊未返情率之间差异不显著（P>0.05）。3人工输精性的影响我们筛选出来的5种稀释液配方最大的特点就在于成本低廉，配制工序简便，组成成分来源广泛充足。在一般小型养殖场内，采集来的绵羊精液一般是现采现用，或仅保存很短时间（约1～2d左右）。所以，我们筛选出的稀释液配方虽然在常温条件下稀释保存羊精液的精子有效存活时间（h）和总存活时间（h）不是很长，但试验结果表明，如果在1天之内输精或是精液品质很好的情况下（活力0.3以上）使用我们筛选出来的稀释液处理羊精液，其羊的人工输精效果还是较好的，是可以作为基层养殖场推广使用的。并且，对于这些小规模养殖场来说，使用我们提供的自配精液稀释液，可以节约一些开支。本试验中，温度是影响精液保存效果的关键因素之一。稀释应等温，以防止低温打击。精液稀释后不能马上放入恒温冰箱，应从38℃缓缓降至室温。保存精液的恒温冰箱温度应在12℃～15℃之间。温度过低，精子因不能耐受而死亡；温度过高，精子的代谢活动增强，但存活的时间缩短。常温保存时，精子在两小时后进入休眠状态，代谢减缓，这样就使其延长了存活时间。放入恒温冰箱之后，还要经常翻动装精液的小瓶，使沉淀的物质尽量溶于稀释液中，防止代谢废物聚集而对精子产生毒害作用。但是在实际操作中，我们放入恒温冰箱的稀释精液降至室温的速度过快，而且翻动装精液的小瓶的频率不够均匀（白天翻动多，夜间翻动少），影响了精液的保存效果。镜检精子活力时精液瓶每天被数次拿进拿出恒温冰箱，导致精液温度波动很大，这对精子的伤害是不可忽视的。所以，本试验中的精液保存应该可以有更好的效果。此外，本次试验样本较少，使试验误差的影响增大，造成筛选的稀释液配方准确度降低，但限于条件和时间有限，重复试验的次数无法再增加。保存精液的恒温冰箱是场内食堂提供的，所以除我们取样做观察时使用外，冰箱也时常被场内工作人员打开使用，这使冰箱内温度波动很大，不恒定，对精子也造成了一定伤害。4精母羊返情率低，材料费用少通过本次试验，我们所筛选出的5种绵羊精液稀释液配方配制方法简单，成分药品容易买到，药品成本比较低廉，精液保存效果较好，人工授精