纤维素酶的检测方法新

纤维素酶的检测办法摘要：本文重要介绍了纤维素酶的降解原理，通过实验比较了四种惯用纤维素酶的检测办法的稳定性，以及纤维素酶的发展前景，为纤维素酶的应用提供了进一步的参考价值。核心词：纤维素酶酶活测定葡萄糖回归方程一、纤维素酶及其降解原理纤维素是高等植物细胞壁的重要成分，占植物总干重的30%-50%，是地球上分布最广，含量最丰富的可再生性碳源化合物，占地球总生物量的40%。据报道，我国每年光作物秸秆，稻梗等含纤维素较丰富的物质就有5亿吨之多，全球每年通过光合作用产生的植物物质高达1.55X109吨，其中尚有89%未被人们运用，而大量的秸秆，稻梗等含纤维素丰富的物质的运用率也很低。大多采用燃烧的方式来解决，这样就造成了环境污染，破坏了土壤的理化性质和丧失了有机质成分。因此，纤维素的充足运用与有效的转化对于解决现在的能源危机，粮食短缺，环境污染等有重大意义。纤维素酶是分解纤维素的一类酶，它能将纤维素分解为葡萄糖，充足的运用了纤维素。自19Sellieres在蜗牛消化液中发现纤维素酶以来，纤维素酶的研究和应用受到了国内外学者的极大关注，获得了很大进展。现在，国内外学者通过筛选产酶菌株来发酵产酶，再应用纤维素酶到食品，医药，饲料，洗涤等工业中，不仅解决了纤维素的再运用问题还获得了很可观的经济效益。纤维素酶是由许多含有高协同作用的水解酶构成的。习惯上将纤维素酶分成三种重要成分：内切酶（内切β-1,4-葡萄糖酶，也称Cx酶）、外切酶（外切β-1,4葡萄糖酶，也称C1酶）、β-1,4葡萄糖酶（即为纤维二糖酶）[1]。C1酶重要作用于天然纤维素，使之转变为非结晶的纤维素。Cx酶又分为Cx1酶和Cx2酶。Cx1酶是一种内断型纤维素酶，它从水合非结晶纤维素分子内部作用于β-（1,4）糖苷键，生成纤维糊精和纤维二塘。Cx2酶是一种外断型纤维素酶，它从水合性纤维素分子的非还原端作用于β-（1,4）糖背键，逐步切断β-（1,4）糖节键生成葡萄糖。纤维二糖酶则作用于纤维二糖，生成葡萄糖。纤维素酶在降解纤维素过程中的作用机理至今还不是很清晰。现在有关Cx酶、C1酶和β-1,4葡萄糖酶这3种酶的作用机理的假说比较公认的是下列3种，其中协同理论最为广泛接受。（1）C1-Cx假说。该理论认为首先由C1酶作用于纤维素酶的结晶区，再由外切酶和β-葡萄糖苷酶联合作用产生二糖和葡萄糖。其水解模式如图1所示。图1C1-Cx假说示意（2）次序作用假说。该假说认为首先由内切酶随机的作用于纤维素的葡萄糖苷键，打开缺口，然后由外切酶在新生键末端切下一种纤维二糖，再由β-葡萄糖苷酶将它水解成葡萄糖。（3）协同作用假说。该理论认为是内切葡萄糖酶首先攻打纤维素的非结晶区，形成外切纤维素酶需要的新的游离末端，然后外切纤维素酶从多糖链的非还原端切下纤维二糖单位，β-葡萄糖苷酶再水解纤维二糖单位形成葡萄糖。二、纤维素酶的检测办法纤维素酶各组分的底物专一性不同，并且纤维素酶是多组分复合物。纤维素酶作用的底物也比较复杂，同时不同来源的纤维素酶其构成及各组分的比例有较大的差别，致使纤维素酶活力的测定办法复杂而不统一。其中重要的检测办法有：棉线切断法，滤纸崩溃法，羧甲基纤维素钠为底物的粘度减少和还原糖增加的测定法[2]，分光光度计法[3]，快速测定纤维素酶CMC液化活力法[4]，平板法，巴鲁阿-斯温(Bamchandswain)测定法[5]。对于细菌等对纤维素分解能力强的微生物，由于对其酶的形成、分泌和作用机制研究较少，这些测定办法不一定合用。但现在对于这些办法测定的具体数值的可信度、可比性，却没有有关的报道研究。下面重要通过四种办法进行实验，研究这些实验办法的稳定性，从而为实验研究提供一定的参考根据[6]。2.1、材料与办法材料：重要仪器HH-6型恒温水浴锅；22PC型分光光度计；HG1001型电热鼓风干燥箱；FA型电子分析天平；UV-2401型紫外双光束分光光度计实验办法：2.1.1试剂的配备：（1）PH4.6醋酸-醋酸钠缓冲液：11.8ml冰醋酸定容至100ml，称取27,2g的醋酸钠溶解并定容至100ml将上述两种溶液等体积混合。（2）3,5-二硝基水杨酸溶液（DNS）：称取3,5-二硝基水杨酸6.3g于500ml大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后加入2mol/mlNaOH溶液262ml，再加入到500ml含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g无水亚硫酸钠搅拌溶解，冷却后移入1000ml容量瓶中，用蒸馏水定容至1000ml，贮于棕色瓶中，室温放置一周后使用。（3）CMC-Na溶液：称取0.625g羧甲基纤维素钠，加热溶解，定容至100ml[7]。2.1.2酶活测定办法葡萄糖原则曲线的绘制原理：3,5-二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范畴内还原糖的量和反映液的强度成比例关系，运用分光光度计测出其在520nm处的吸光度，得出还原糖的量。葡萄糖原则溶液的配制：将葡萄糖放在110℃烘箱中烘2h至恒重，称取0.1080g烘好的葡糖糖，溶解并定容至100ml。取16支具塞试管，依次编号为0,1,2,3,4,5,6,7并作平行实验。由于多个办法反映体系的总体积不同，因此需作不同的原则曲线，所加的量也有所不同。现以总体积为9ml体系为例：表1葡萄糖原则曲线绘制办法管号01234567葡萄糖量（ml）00.511.522.533.5蒸馏水（ml）76.565.554.543.5DNS(ml)22222222摇匀后置于沸水浴中加热5min后，冷却定容至25ml。摇匀后以0号管为对照于最大吸取波优点测定OD值，以葡萄糖含量μmol为横坐标，OD值为纵坐标，绘制原则曲线。酶活测定办法的比较配制不同浓度的原则酶液：用去离子水100ml来溶解100mg纤维素酶（≥1000IU），配制成1mg/ml酶液。测定时分别吸取0.1ml，0.2ml，0.3ml，0.4ml，0.5ml，0.6ml上述酶液用水补足至1ml即为不同浓度的酶液。（1）滤纸酶活（FPA）测定办法滤纸是聚合度和结晶度都居“中档”的纤维性材料，以其为底物经纤维素酶水解后生成还原糖的量来表征纤维素酶系总的糖化能力的办法，此办法应用广泛，它反映了三类酶组分的协同作用，统称滤纸酶活（FilterPaperActivity，FPA）办法：取1ml酶液加1ml0.1mol/L、Ph4.6的醋酸缓冲液，预热到50℃，加入1条1x6cm新华滤纸（50±1mg），50℃保温1h。取出，沸水浴灭活5min，冷却至室温，用3mlDNS试剂显色后稀释3倍，测OD值（520nm）。OD值越大，阐明该菌株的酶活力越强[8]。酶活力计算：从原则曲线中查出葡萄糖μmol数；酶活力（μ/ml）=其中：60为保温时间（酶与底物作用时间，min）；Ew为粗酶液的体积（ml）；μ是指在特定条件下，每分钟催化纤维素水解成1μmol葡萄糖的酶量。（2）羧甲基纤维素钠盐（CMC-Na）酶活性测定办法原理：纤维素酶对CMC-Na有降解能力，生成葡萄糖等还原糖，再用DNS法显色，用原则葡萄糖溶液作原则液，22PC分光光度计在520nm处测其吸光度，以每分钟生成相称于1μmol的葡萄糖为一种酶活性单位。取3支带有20ml刻度的试管，1支管作空白对照，2支管作平行样品管。每支样品管中加1ml酶溶液，置于50℃水浴锅中预热2min，然后在3支试管中分别加入4ml已预热至50℃的底物溶液，精确计时5min取出，每管立刻分别加入1ml2mol/L氢氧化钠溶液和2mlDNS显色液，摇匀后在对照管中再加入1ml酶液。将3支试管放入沸水浴中，5min后立刻取出，流水冷却，用蒸馏水定容至20ml，于520nm处测OD值。酶活力计算：从原则曲线中查出葡萄糖μmol数；酶活力（μ/ml）=其中：5为保温时间（酶与底物作用时间，min）；Ew为粗酶液的体积（ml）；μ是指在特定条件下，每分钟催化纤维素水解成1μmol葡萄糖的酶量。（3）染色纤维素测定办法[9]用考马斯亮蓝使滤纸染色酶解后在最大吸取波优点测释放的着色物的吸光值，代表酶活，以吸光度为纵坐标，酶浓度为横坐标做曲线。在实际测定时，先运用紫外双光束分光光度计进行波长扫描，发现其在536nm处吸取峰最高，因此在实验时以此波长作为测定波长。（4）CMC粘度减少测定办法底物溶液9ml，加酶液1ml，40℃，测定底物粘度减至二分之一时所需时间，以奥氏粘度计测定。以10min能使底物粘度减少二分之一的酶活作为一种单位。2.2成果与分析葡萄糖原则曲线绘制实验中所用的原则葡萄糖曲线绘制成果以下：由于在后来的测定中，各办法的反映体系并不相似，因此每个体系须有各自的葡糖糖原则曲线作为此后的参考。CMC糖化力测定参考图1，有三条曲线，是由于在惯用测定中酶与底物不同，而造成它们各自体系的溶液的总体积也不相似，因此此办法的葡萄糖原则曲线有三条。滤纸法参考图2。图1CMC酶活测定法葡糖糖原则曲线(不同体系)所得三条曲线的回归方程以下：y1=0.0292x-0.0101R12=0.9981y2=0.0211x-0.0107R22=0.9965y3=0.0163x-0.0074R32=0.9955图2滤纸法葡糖糖原则曲线所得曲线的回归方程：y=0.1418x-0.0141R2=0.998原则纤维素酶酶活曲线酶活测定办法成果比较以下：表2原则纤维素的CMC酶活力和滤纸酶活力测定成果CMC酶活力测定法滤纸酶活力测定法（FPA）含酶量（mg/mL）OD值查得葡萄糖量（μmol）酶活（U/mL）OD值查得葡萄糖量（μmol）酶活（U/mL）00000000.20.1023.840.7680.0540.4800.0080.30.1465.351.0690.0900.7340.0120.40.2027.261.4530.1150.9100.0150.50.2589.181.8360.1481.1440.0190.60.29610.482.0970.1821.3800.023所得曲线的回归方程:y=3.5908xR2=0.9973y=0.0383xR2=0.9985实验成果表明：用原则纤维素酶所做的CMC酶活测定和滤纸酶活测定，从回归曲线能够看出他们的线性较好，能够充足阐明这2种办法比较稳定。并且CMC酶活测定法和滤纸酶活测定法在诸多报道中均在采用，这样使实际实验的成果更具可比性。所得曲线的回归方程：y=0.728x-0.029R2=0.8828所得曲线的回归方程：y=0.0316x-0.0007R2=0.979由上述成果可知：CMC粘度减少法的线性没有滤纸酶活测定法和CMC酶活测定法来得好，并且在实验过程中，两个平行实验之间有较大的误差。但从回归方程就能看出，该办法的稳定性较其它3种办法有很大的偏差。表3原则纤维素的CMC粘度减少法和染色纤维素法测定成果CMC粘度减少法染色纤维素法含酶量（mg/mL）所用时间（min）酶活（U/mL）OD值酶量（mg）000000.277.40.1290.00480.20.360.60.1650.00930.30.445.30.2210.01070.40.537.50.2670.01440.50.620.00.5000.01950.62.3结论本次实验研究了纤维素酶测定办法中惯用的4种办法，即：FPA测定法、CMC-Na酶活性测定法、染色纤维素测定法以及CMC粘度减少测定法，比较了这4种办法测定的线性有关性以及稳定性，通过实验研究表明，FPA测定法和CMC-Na酶活性测定法较稳定，线性有关性较高，能够作为研究测定的可靠办法。三、纤维素酶的应用与发展趋势纤维素酶可广泛用于食品、纺织、饲料、酿酒、石油勘探、中药成分提取等众多领域，特别是在纺织、洗涤、造纸、和生物能源等工业应用上含有重要地位。自20世纪90年代开始，酸性纤维素酶用于牛仔布的水洗整顿(biostoningandbiofinishing)，从而开始了纤维素酶在工业上的大规模应用，这也是现在纤维素酶应用最成功、用量最大的领域。在牛仔布的水洗整顿上酸性纤维素酶含有用量少、效果快的特点，但服装返染严重；中性纤维素酶反映条件温和并且不易返染，织物档次得到提高，已普遍替代酸性酶。但在棉织物的整顿上，如去球(depilling)脱毛(reducedfuzz)以及增柔(softness)等，酸性纤维素酶特别是木霉产生的纤维素酶仍含有更多的优势。运用纤维素酶对棉织物的整顿并不需要纤维素酶的全部组分，如进行棉织物的脱毛、去球等整顿，仅有内切酶就可产生明显的效果，但是棉织物的减量也较严重，影响了织物的强度，通过基因工程变化内切酶和外切酶的比例，能够在一定程度上解决这个问题。纤维素酶用于造纸工业，是运用外切纤维素酶只从末端切断纤维素的作用原理，提高纸张的光洁度。碱性纤维素酶用于洗涤剂工业，能够提高棉织物的洗净度，起重要作用的是内切酶(CMC酶)，是近些年来洗涤剂工业竞相开发的新酶种之一。这两种工业应用涉及的纤维素酶只需要纤维素酶系中的单一组分，基因工程技术能够在其中得到广泛的应用。纤维素酶将来最大的用途，或者能够使其产量得到巨大增加的工业需求将是纤维素乙醇的开发。自上世纪70年代石油危机以来，世界各国都致力于开发新的可再生能源，而生物乙醇(bioeth-anol)是被普遍看好的新型燃料。进入21世纪，运用纤维素酶转化纤维素物质产生葡萄糖进而发酵获得生物乙醇，能够避免对粮食作物的大量损耗，引发了各国政府和研究机构的重视，这其中的核心是纤维素酶的成本问题。由于纤维素酶发酵活力较低，因此其应用成本也较高。同时纤维素酶相比其它糖苷水解酶类，比活力最少要低1~2个数量级，如滤纸酶的比活力为1IU/mg左右，CMC的比活力约为10IU/mg，从而造成酶的作用效率较低。这是两个限制纤维素酶应用的瓶颈问题，也是纤维素酶研究的热点与难点。现在通过传统的菌种诱变和基因工程技术能够较大幅度地提高目的蛋白的体现量，从而提高酶的发酵水平，如诺维信公司与美国能源部合作，将制造纤维素乙醇中的酶制剂成本由的每加仑5美元减少到的30美分，又减少到每加仑18美分。还能够通过改善发酵条件和工艺，如采用固体发酵来大幅度减少发酵成本。但是提高酶降解天然纤维素的效率则需要，进一步研究纤维素酶