全基因组单核苷酸多态性微阵列芯片在家系下一胎产前遗传诊断中的应用

全基因组单核苷酸多态性微阵列芯片在家系下一胎产前遗传诊断中的应用

prace综合征（pw；omim176270）被称为低肌力障碍、智力发育障碍综合征，最初由praceandcabban和wrei任命。这是由于父亲的基因（15q11-13）随土壤类型而改变的遗传疾病，发病率为1.15万。Angelman综合征(AS;OMIM105830)又称快乐木偶综合征,于1965年首次报道,是由母源15q11-13区域泛素蛋白连接酶E3AUBE3A基因缺陷或其表达降低引起,发病率为1/12000。对PWS和AS疑似患者进行分子遗传学诊断,有利于患儿的确诊、治疗干预,并为家庭下一胎的产前诊断提供重要的信息。常规G显带染色体核型分析无法检出PWS和AS,目前主要通过甲基化特异性聚合酶链反应(methylation-specificpolymerasechainreaction,MS-PCR)、多重连接依赖的探针扩增(multiplexligationdependentprobeamplification,MLPA)、荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)及微阵列比较基因组杂交(array-basedcomparativegenomichybridization,array-CGH)技术对这两种疾病进行分子遗传学诊断。SNP-array作为一种快速准确的高分辨率细胞分子遗传学检测技术,可以实现人类全基因组高分辨率的快速扫描,发现可能存在的致病性微缺失或者微重复,并可精确定位基因组异常位置、大小及其来源。本研究用SNP-array技术对3例疑似为PWS和AS的患儿进行了分子遗传学诊断,为患儿家庭下一胎妊娠提供了产前遗传学诊断。1对象和方法1.1韦氏智力量表型临床分型2011年1月至2012年12月南京市妇幼保健院优生优育遗传门诊就诊的3例疑似PWS和AS患儿,其父母要求明确诊断并提供下一胎的产前诊断。采集患儿外周血和临床信息,具体如下:患儿1,男,14岁,足月顺产,出生时肌张力低下,喂养困难;幼年期食欲亢进,明显肥胖,且伴智力低下。目前身高120cm,体重75kg。杏仁眼、上嘴唇上翘,双侧隐睾,言行异常,神经自主性差,表情快乐,少量低色素沉着,痛觉神经不敏感。韦氏智力量表显示智力中度低下(为北京儿童医院检查结果)。根据其临床表型,临床诊断为PWS。患儿2,女,6岁,足月顺产,出生时体重2.3kg,3岁多经康复训练会走路,发育迟缓。目前身高115cm,体重20kg。不会说话,喜伸舌,嘴角向下,无故大笑,智力严重低下,共济失调,肌张力低下。根据临床表型,临床诊断为AS。患儿3,女,5岁,足月顺产,出生时体重3kg,5个月大时经常感冒发热,纳食差,吃多易呕吐,易腹泻,8个月大时不会爬,不会抬头。目前身高108cm,体重18kg。伸舌流口水,大小便不能自理,语言能力差,不会说话,听不懂话,多动,不会走路,癫痫,睡眠少易惊厥,智力停留在1岁前,脑电图异常。根据临床表型,临床诊断为AS。3位患者在本院做G显带染色体核型分析结果均未见异常,双亲身体健康并否认近亲结婚,否认遗传家族史。3个家庭因生育以上3个患儿,计划生育下一胎来我院产前诊断门诊进行遗传咨询和相关检测。本研究经医院医学伦理委员会批准,患者家属知情同意。1.2基因组dna提取抽取1例体检健康者(南京市妇幼保健院体检中心)和3位患儿及其双亲静脉血2mL于EDTA抗凝管中,获取患儿母亲新鲜羊水(孕18~20周)10mL,1000r/min离心10min,留取细胞沉淀,按照QIAampDNABloodMiniKit(德国Qiagen公司)说明书操作,提取各样本基因组DNA。用洗脱液洗脱DNA,Nanodrop2000分光光度计(美国Thermo公司)测定DNA浓度,保持DNA样本吸光度(A260/280nm)为1.7~1.9,DNA样本置-80℃保存。1.3snp-arrae检测取200ngDNA样本(4μL),按照HumanCytoSNP-12BeadChipKits芯片(Illumina公司)说明书操作进行SNP-array检测,采用iscan扫描系统进行数据采集,用Karyostudio软件分析结果。2结果2.1探针检测位点检测样本经芯片扫描及Karyostudio软件分析,将拷贝数变异(CNVs)的检测阈值设为500×103bp和20个探针检测位点,可信度大于80。结果发现3例患儿SmoothedLogR值在15q11-13区域显著下降(图1),BalleleFreq只有两种形式(A、B),原来的杂合性(AB)丢失,显示此区段发生了缺失。表明此区段有基因组杂合性缺失存在,缺失大小和位置见表1。2.2snp-arras:妊娠合并妊娠后再发风险患儿父、母亲的SNP-array检测结果未见基因组CNV异常,提示这3个微缺失均为新发从头(起始,denovo),理论推测下一次妊娠的染色体微缺失的再发风险较低。SNP-array检测结果发现3位母亲的羊水细胞均未发现基因组异常,排除胎儿患PWS和AS的可能。出生后3个月和6个月的电话随访中,均未发现3例婴儿有异常临床症状。2.3snp基因型的比较根据父母和患儿SNP-array基因分型结果,选择缺失区域中父母SNP位点基因型不一致的纯合性SNP位点进行SNP基因型的比较分析。结果发现1例为父源性等位基因缺失(患儿1),2例为母源性等位基因缺失(患儿2、3)。3pcr和as基因表达失衡本研究中患儿1在新生儿期呈现出肌张力低下、吸吮无力、喂养困难、少哭少动;幼儿期以后常出现过度饮食、肥胖、矮小、智力低下、行为异常、性腺发育障碍(隐睾),并呈现出特殊面容:窄长脸、杏仁眼、大下巴,这与PWS典型临床症状一致。另外,患儿还表现出少量的低色素沉着以及痛觉神经不敏感。Cheng等发现PWS患儿常存在掌指关节僵直现象,可能与肌张力低下长时间固定化姿势有关,在本研究中未发现此现象。患儿2、3临床症状主要有生长发育迟缓、严重运动和智力障碍、肌张力低下、癫痫、语言障碍症状,与AS的典型临床症状高度一致,此外均伴有明显的兴奋动作和手扑翼样运动、多动、注意力仅能短暂集中等。PWS和AS是由15q11.2-13.2区域关键基因表达失衡引起。SNRPN,NDN,MAGEL2,MKRN3印记基因仅在父源等位基因上具有活性,当这些父源性基因功能缺陷将导致PWS。现已明确的基因缺陷类型包括(1)父源性15q11-13缺失,约占70%;(2)母源性15q11-13单亲二体(uniparentaldisomy,UPD),约占20%~25%;(3)基因印记缺陷,约占2%~4%;(4)染色体平衡易位及其他罕见原因,占比<1%。AS是由母源15q11-13区域UBE3A缺陷引起,缺陷类型包括(1)新发母源性15q11-13缺失,约占70%;(2)父源15q11-13UPD,占5%~7%;(3)印记中心缺陷占3%~5%;(4)UBE3A的点突变或小缺失占11%;(5)原因不明,约11%。在PWS和AS中,由于缺失型占的比例较大,因此首选CNV检测手段进行拷贝数检测。本研究通过SNP-array检测,诊断出3例患儿均为15q11-13缺失型,结合患儿的临床症状和SNP位点的基因型比对分析,得出患儿1为PWS,患儿2、3为AS的临床诊断。对3位患儿双亲进行SNP-array检测,在15q11-13区域均为正常二倍型,在其他染色体区域也未见致病性CNV,故患儿均属于新发的杂合性微缺失,推测下一次妊娠出现微缺失的风险较低。三位患儿母亲在生育二胎的中孕期(18~24周)先后来我院进行产前遗传门诊咨询,经知情同意做羊水细胞SNP-array检测,结果均正常,排除了再发风险。出生后的电话随访也证实了三个婴儿未出现异常临床症状,与遗传检测结果一致。P