无酶标记h-igg电流型免疫传感器的研究

无酶标记h-igg电流型免疫传感器的研究

免疫传感器是一种结合高灵敏传感器和高灵敏传感器的新生物传感器。它被用来分析和研究痕迹免疫原因。在各种免疫传感器的研究中，由于其高灵敏度和简单的设备，许多国内外科学家对其感兴趣。然而，由于它们的高灵敏度和简单设备，它们通常需要酶标记抗感染或转化信号，提高传感器的检测灵敏度。该传感器有以下缺点：一些特殊的酶标记很难获得。需要一个电子媒体。检测过程中的加工方法相对复杂。因此，基于新技术、低标记或电子手段的革命性免疫传感器，以及快速、灵敏的检测方法，对医学研究和临床检测具有重要意义。近年来，一些中国科学家在不到应用标记或不到电子手段的情况下对没有酶标记或电子手段的电流免疫传感器进行了一些研究。例如，西南大学袁若群在电沉积物、电聚合和层压结构上制作了一系列无酶免疫传感器。该免疫传感器是一种无酶免疫传感器，需要专门的电子显微镜技术和电子显微镜。大学蔡培祥教授将实验与金融石缩技术相结合，检测乙肝蛋白酸钠。上述研究简化了检测步骤，但存在电子媒体泄漏、抗性固定量低、无酶指数、灵敏度和稳定性等问题。此外，目前的利率免疫传感器主要是通过检测生物体和抗逆反应前后电极上的循环伏安电流或即时电流来达到检测目标的新方法。然而，关于不规则脉冲伏安免疫传感器的研究很少。对于不规则脉冲伏安免疫传感器没有报道，关于不规则脉冲伏安免疫传感器的研究很少。本文采用自组装技术,以一种容易获得、可在金电极表面自主装的L-半胱氨酸化合物为基底结合Nano-Au,并固定羊抗人免疫球蛋白抗体(anti-h-IgG),利用差分脉冲伏安法检测免疫反应前后L-半胱氨酸对多巴胺催化电流的变化,制备了无酶标记且无电子媒介体的h-IgG电流型免疫传感器.其创新点如下:①该传感器制备及反应过程中没引入电子媒介体,故无电子媒介体渗漏、富集等不良问题,进一步提高了电极稳定性;②该电极在反应过程中没引入酶,而是利用L-半胱氨酸对多巴胺很强的直接电催化作用放大电信号,因此抗体占据了电极上几乎所有的活性位点,增大抗原与抗体结合的机会;③通过Nano-Au固定在电极上的抗体可以保持良好的生物活性,从而提高了电极的灵敏度;④每次免疫反应发生后,电极转入含多巴胺的PBS溶液中用差分脉冲伏安法测定电流变化,避免了样品中干扰物的干扰.1实验部分1.1氨基酸l-半胱氨酸羊抗人IgG抗体(anti-h-IgG,上海生物制品研究所,效价1∶140),人血浆免疫球蛋白(h-IgG,成都生物制品研究所);L-半胱氨酸(上海康达氨基酸试剂厂);牛血清白蛋白(BSA)、多巴胺(Sigma公司);其余试剂均为分析纯,购自四川化学试剂厂.实验用水为二次蒸馏水.CHI660A型电化学工作站(上海辰华仪器公司).三电极系统:anti-h-IgG抗体修饰电极为工作电极,饱和甘汞电极为参比电极,铂丝电极为对电极,以含0.35mmol/L多巴胺的0.25mol/LPBS溶液(pH=6.5)为测试底液.1.2纳米金设备纳米金(Nano-Au)的制备参照文献.1.3nano-au/4.2戊二醛/3.5%戊二醛电极的制备将经过预处理的金电极(ϕ=4.0mm)插入20mmol/LL-半胱氨酸(pH=6.5)溶液中浸泡2h后,分别在Nano-Au(4℃,4h)或1%戊二醛(常温1h)溶液中浸泡,然后将电极浸泡在anti-h-IgG溶液中(4℃,1.5h),最后以1%BSA封闭电极上非特异性结合位点,取出,水洗后置于4℃冰箱中保存待用.1.4dpv的测定除非特殊说明,每次检测前,电极在0.25mol/LPBS(pH=6.5)含不同抗原浓度的溶液中孵育10min,然后转入含0.35mmol/L多巴胺的PBS(pH=6.5)溶液中,利用DPV检测其电流变化,然后以ΔI=I0-I计算,其中,I0代表修饰电极与抗原反应前在测试底液中的电流,I代表修饰电极与待测抗原反应后在测试底液中的电流.2结果与讨论2.1修饰电极的稳定性以不同修饰状态的电极为工作电极,于含0.35mmol/L多巴胺的0.25mol/LPBS(pH=6.5)测试底液中,在-0.2～0.6V范围内进行DPV测定,所得DPV曲线如图1所示.图1曲线a是L-半胱氨酸修饰裸金电极后的DPV曲线,可见有一明显的峰电流曲线,这是因为L-半胱氨酸对多巴胺有强的催化作用.当该L-半胱氨酸电极吸附Nano-Au后,峰电流值增大(图1曲线b),这是因为纳米金具有导电性,能促进电子的传递.Nano-Au组装了无电活性的anti-h-IgG后,因为anti-h-IgG占据并堵塞了部分孔径通道,使多巴胺向L-半胱氨酸及Nano-Au扩散的有效表面积减小,阻碍了L-半胱氨酸对多巴胺的催化,也降低Nano-Au的导电性能,从而使峰电流值减小(图1曲线c),这是当用BSA封闭电极上非特异性结合位点后,峰电流值进一步减小(图1曲线d).该修饰好的免疫电极在20ng/mL的h-IgG溶液中培育10min后于测试底液中得到的DPV曲线(图1曲线e),由于h-IgG与anti-h-IgG的专一性免疫反应,生成的复合物堵塞了更多的孔径通道,使多巴胺向L-半胱氨酸扩散的有效表面积再减小,再次阻碍了L-半胱氨酸对多巴胺的催化,从而使响应电流进一步下降,即Ie<Id.交流阻抗谱图进一步证明anti-h-IgG在金电极表面的固定.图2是不同修饰状态的电极在Fe(CN)64-/3-溶液中的交流阻抗谱图.从图可以看出,随着电极表面的逐层修饰,阻抗随之发生变化,并且半圆的直径约为电子传递的阻抗(Ret).当裸金电极被L-半胱氨酸修饰后,出现了高频Ret阻抗(250兆)(图2a),当L-半胱氨酸修饰金电极吸附Nano-Au后(图2b),其交流阻抗略小于L-半胱氨酸的阻抗,原因是纳米尺寸的金溶胶有增强电子传递的能力.当抗体(图2c)和牛血清白蛋白(图2d)分别固定在电极上后,堵塞了修饰电极表面更多孔径通道,致使电极表面扩散的有效截面积进一步变小,进一步增大了Fe(CN)63-到电极表面参加反应的阻力,故膜本体阻抗依次增大,其阻抗均远远高于Nano-Au/L-半胱氨酸/电极.2.2免疫电极的选择性两种不同抗体固定方法的免疫响应见图3.由图可知由戊二醛做交联剂固定抗体制备的免疫传感器(图3曲线b),电极的电流响应比由Nano-Au固定抗体制备的免疫传感器的电流响应低(图3曲线a),这是因为采用戊二醛共价键合固定抗体可能使抗体分子的部分活性位点被键合失活,不利于免疫反应的进行,导致灵敏度低,而Nano-Au能促进电子的传递,其大的比表面积增加了抗体的固定量,且固定后的抗体能保持良好的生物活性,从而提高了电极的灵敏度.图4是免疫电极与20ng/mLh-IgG反应后,在0.25mol/LPBS(pH=6.5)中不同多巴胺浓度对电流响应的影响.由图可见,当多巴胺浓度超过0.35mmol/L,传感器的电流响应不再增加,故0.35mmol/L多巴胺浓度为最佳浓度.图5为该免疫传感器对h-IgG的动力学响应曲线.由图可见,至10min左右,响应电流基本达到平稳,故实验过程中选用的最佳培育时间是10min.该免疫电极与20ng/mLh-IgG反应后,在0.25mol/LPBS(pH=6.5)中含0.35mmol/L多巴胺的不同pH溶液中测定其电流响应.实验结果表明,在pH=6.5时电流响应达到最大值.故本实验选择测试底液的pH为6.5.2.3传感器的电流响应值.在最优条件下将该免疫传感器与不同浓度待测溶液反应后,测定其电流响应值.实验结果表明,该传感器在0.80～90ng/mL的范围内保持良好的线性关系(图3a),y=0.0478x+0.4215,R2=0.9966.2.4h-igg重现性检测抗坏血酸、硝基酚、肾上腺素等对该传感器的测定均有较大影响,由于每次免疫反应发生后,电极转入无上述干扰物的含多巴胺的PBS中测定,由此避开了h-IgG样品中的干扰物.取浓度为40ng/mL的4份h-IgG进行重现性检测,相对标准误差为6.1%.将此传感器对5份不同浓度的h-IgG样品进行检测,样品的回收率为98.6%～103.5%.用盐酸-氨基酸对传感器进行9次再生后,该传感器的电流响应值仍可保持原电流响应值91.0%.3nano-au免疫传感器以L-半胱氨酸为基底结合纳米金,然后固定抗体,利用L-半胱氨酸对多巴胺的直接电催化作用制备了无酶标记且无电子