高效液相色谱法讲义（包含讲义和试验）

本文格式为Word版，下载可任意编辑——高效液相色谱法讲义（包含讲义和试验）高效液相色谱仪在基础有机化学试验产物分析中的应用

第一部分：基础理论部分

一、色谱法简介1.色谱法简史

1906年俄国植物学家茨维特（Tswett）首次提出“色谱法〞（Chromatography）的概念。他在论文中写到：“（原文）植物色素的石油醚溶液从一根主要装有碳酸钙吸附剂的玻璃管上端参与，沿管滤下，后用纯石油醚淋洗，结果依照不同色素的吸附顺序在管内观测到它们相应的色带，就像光谱一样，称之为色谱图。〞2.色谱法分类

色谱过程的本质是待分开物质分子在固定相和滚动相之间分派平衡的过程，不同的物质在两相之间的分派会不同，这使其随滚动相运动速度各不一致，随着滚动相的运动，混合物中的不同组分在固定相上相互分开。根据物质的分开机制的不同，又可以分为吸附色谱、分派色谱、离子交换色谱、凝胶色谱、亲和色谱等类别。（1）吸附色谱

吸附色谱利用固定相吸附中心对物质分子吸附能力的差异实现对混合物的分开，吸附色谱的色谱过程是滚动相分子与物质分子竞争固定相吸附中心的过程。（2）分派色谱

分派色谱是利用固定相与滚动相之间对待分开组分溶解度的差异来实现分开。分派色谱的固定相一般为液相的溶剂，依靠图布、键合、吸附等手段分布于色谱柱或者担体表面。分派色谱的色谱过程本质上是组分分子在固定想和滚动相之间不断达到溶解平衡的过程。（3）离子交换色谱

离子交换色谱利用被分开组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实

现分开。离子交换色谱的固定相一般为离子交换树脂，树脂分子结构中存在大量可以电离的活性中心，待分开组分中的离子会与这些活性中心发生离子交换，形成离子交换平衡，从而在滚动相与固定相之间形成分派。固定相的固有离子与待分开组分中的离子之间相互争夺固定相中的离子交换中心，并随着滚动相的运动而运动，最终实现分开。（4）凝胶色谱

凝胶色谱的原理比较特别，类似于分子筛。待分开组分在进入凝胶色谱后，会依据分子量的不同，进入或者不进入固定相凝胶的孔隙中，不能进入凝胶孔隙的分子会很快随滚动相洗脱，而能够进入凝胶孔隙的分子则需要更长时间的冲洗才能够流出固定相，从而实现了根据分子量差异对各组分的分开。调整固定相使用的凝胶的交联度可以调整凝胶孔隙的大小;改变滚动相的溶剂组成会改变固定相凝胶的溶涨状态，进而改变孔隙的大小，获得不同的分开效果。二、高效液相色谱法简介1.高效液相色谱发展背景

液相色谱法发展初期是用大直径的玻璃管柱在室温柔常压下用液位差输送滚动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。高效液相色谱法(HighperformanceLiquidChromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送滚动相，故又称高压液相色谱法(HighPressureLiquidChromatography，HPLC)。又因分析速度快而称为高速液相色谱法(HighSpeedLiquidChromatography，HSLP)。也称现代液相色谱。一句话，高效液相色谱是以高柱效小颗粒填料为载体，以高压泵为滚动相驱动力，对物质进行快速分开和分析的方法。

2.高效液相色谱的特点

高效液相色谱的“高效〞主要表达在以下“四高〞：

（1）高压

滚动相为液体，流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必需对载液加高压。（2）高速

分析速度快、载液流速快，较经典液体色谱法速度快得多，寻常分析一个样品在15～30分钟，有些样品甚至在5分钟内即可完成，一般小于1小时。（3）高效

分开效能高。可选择固定相和滚动相以达到最正确分开效果，比工业精馏塔和气相色谱的分开效能高出大量倍。（4）高灵敏度

紫外检测器可达0.01ng，进样量在μL数量级。三、高效液相色谱的组成

1.系统结构简图（以安捷伦1220为例）

如上图所示，高效液相色谱主要有储液瓶、高压泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱工作站组成。

2.储液瓶和脱气机

主要用于存储滚动相（溶剂或缓冲液）和除去滚动相中的气泡。

滚动相进入高压泵之前必需脱气（脱气机一般包含在高压泵组件中），特别是水和极性溶剂。否则气泡进入色谱柱以后，将影响分开效率、基线不稳使检测器灵敏度降低，甚至不能正常工作。3.高压泵

色谱柱用细粒填料，填充紧凑，液体滚动相粘度高，阻力大，必需高压输液。高压泵是高效液相色谱的关键部件，直接影响整个仪器和分析结果的可靠性。

高压泵分为两类：恒流泵和恒压泵。恒流泵：柱阻力变化，滚动相粘度变化，引起柱压变化而流量恒定，如往复柱塞泵。恒压泵：流量可随外界阻力变化而输出压力恒定，例如装柱用的气动泵。HPLC广泛采用往复柱塞泵，由液缸，柱塞，单向阀和驱动机构组成。密封圈耐磨（PTF-石墨）单向阀，柱塞为人造红宝石。

泵流量不稳将影响化合物的保存时间，直接影响峰面积重现性和定量精度，使噪音变大，最小检测量变大。双柱塞泵流量平稳，输液精度高，流量精量+/-0.1%，流量确凿度+/-1%。双柱塞泵液缸容积很小（几微升~几百微升）适于梯度洗脱。为提供无脉动的确凿流量，在输液系统中还需加一些辅助设备：过滤器、混合器、阻尼器，测压装置。多元混合溶剂需用比例阀，如二元、三元和四元比例阀。溶剂按预定比例，低压混合后，经高压泵输入系统。4.进样系统

HPLC采用六通阀进样，重现性好，操作便利，易于自动化，大大提高了分析精度。

注射器进样：绝对误差在5%左右，相对误差在1%。

阀进样：误差均在1%以内。进样量由定体积定量管和平头微量注射器控制，注射器体积应为定量管体积的2~3倍。HPLC柱可注入较大体积的稀溶液，进样体积在10~250ul。

对于多样品的连续分析，可以采用自动进样系统；该系统可以在软件的控制下，自动逐个进样。

5.色谱柱

色谱柱是色谱仪最重要的部件。寻常用厚壁玻璃管或内壁抛光的不锈钢管制作的，对于一些有腐蚀性的样品且要求耐高压时，可用铜管、铝管或聚四氟乙烯管。柱子内径一般为1～6mm。常用的标准柱型是内径为4.6或3.9mm，长度为15～30cm的直形不锈钢柱。填料颗粒度5～10μm，柱效以理论塔板数计大约7000～10000。色谱柱的发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。

填料的类型决定了色谱柱的用途。液相色谱柱的分开作用是在填料与滚动相之间进行的，柱子的分类是依据填料类型而定。

正相柱：多以硅胶为柱填料。根据外型可分为无定型和球型两种，其颗粒直径在3—10μm的范围内。另一类正相填料是硅胶表面键合—CN，-NH2等官能团即所谓的键合相硅胶。

反相柱：主要是以硅胶为基质，在其表面键合十八烷基官能团(ODS)的非极性填料。也有无定型和球型之分。

常用的其他的反相填料还有键合C8、C4、C2、苯基等，其颗粒粒径在3—10μm之间。6.检测器

高效液相色谱仪的检测器主要用于分析样品信号的采集，常用的检测器有紫外检测器、荧光检测器、示差检测器、电导检测器、光电二极管阵列检测器等。（1）紫外检测器

它是利用被分析样品对特定波长紫外光的选择性吸收，组分浓度与吸光度