蛋白质的定量测定方法

蛋白质的定量测定方法蛋白质的定量分析是生物化学和其它生命学科最常涉及的分析内容，是临床上诊断疾病及检查康复情况的重要指标，也是许多生物制品，药物、食品质量检测的重要指标。在生化实验中，对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析，则是经常进行的一项非常重要的工作。蛋白质是一种十分重要的生物大分子：它的种类很多，结构不均一，分子量又相差很大，功能各异，这样就给建立一个理想而又通用的蛋白质定量分析的方法带来了许多具体的困难。目前测定蛋白质含量的方法有很多种，下面列出根据蛋白质不同性质建立的一些蛋白质测定方法：

物理性质：紫外分光光度法。

化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry法，BCA法，胶体金法。

染色性质：考马氏亮蓝染色法、银染法。

其他性质：荧光法。

蛋白质测定的方法很多，但每种方法都有其特点和局限性，因而需要在了解各种方法的基础上根据不同情况选用恰当的方法，以满足不同的要求。例如凯氏定氮法结果最精确，但操作复杂，用于大批量样品的测试则不太合格；双缩脲法操作简单，线性关系好，但灵敏度差，样品需要量大，测量范围窄，因此在科研上的应用受到限制；而酚试剂法弥补了它的缺点，因而在科研中被广泛采用，但是它的干扰因素多；考马氏亮兰染色法因其灵敏而又简便开始重新受到关注；BCA法又以其试剂稳定，抗干扰能力较强，结果稳定，灵敏度高而受到欢迎；胶体金法具有较高的灵敏度，可达到毫微克水平，用于微量蛋白的测定。常用的测定蛋白质含量方法的比较下面介绍Folin—酚试剂法，考马氏亮蓝G—250染色法，紫外分光光度法、胶体金法等几种最常用使用的方法。一、

Folin－酚试剂法（又名Lowry）法一、实验原理这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难（现在已可以订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。在生物化学领域得到广泛的应用。此法可检测的最低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20~250mg。二、优缺点优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多；缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。三、试剂与器材1.试剂（1）试剂甲：（A）10克Na2CO3，2克NaOH和0.25克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6·4H2O），溶解于500毫升蒸馏水中。（B）0.5克硫酸铜（CuSO4·5H2O）溶解于100毫升蒸馏水中，每次使用前，将50份（A）与1份（B）混合，即为试剂甲。（2）试剂乙：在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠，25克钼酸钠及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克硫酸锂，50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1N左右。（3）标准蛋白质溶液:精确称取结晶牛血清清蛋白或球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为250mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用0.9%NaCl溶液。2.器材（1）可见光分光光度计；（2）旋涡混合器；（3）秒表；（4）试管16支。四、操作方法1.标准曲线的测定：取16支大试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分成两组，分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升标准蛋白质溶液（浓度为250mg/ml）。用水补足到1.0毫升，然后每支试管加入5毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（20～25℃）放置10分钟。再逐管加入0.5毫升试剂乙（Folin—酚试剂），同样立即混匀。这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于700nm处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。注意：因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即第1支试管加入5毫升试剂甲后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入5毫升试剂甲，2分钟后加第3支试管，余此类推。全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟，则第1支试管可立即加入0.5毫升试剂乙，1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙，2分钟后加第3支试管，余此类推。待最后一支试管加完试剂后，再放置30分钟，然后开始测定光吸收。每分钟测一个样品。进行多试管操作时，为了防止出错，必须在实验记录本上预先画好下面的表格。表中是每个试管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的顺序，逐管加入。最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量（微克）和测得的吸光度值。2.样品的测定：取1毫升样品溶液（其中约含蛋白质20~250微克），按上述方法进行操作，取1毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起，同时进行。即在标准曲线测定的各试管后面，再增加3个试管。如上表中的8、9、10试管。根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。注意，由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。五、注意事项（1）对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰Lowry反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素（0.5%），硫酸钠（1%），硝酸钠（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。（2含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液，即可显色测定。若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1~2倍。进行测定时，加Folin—酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定，但上述还原反应只在pH=10的情况下发生，故当Folin一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。考马斯亮蓝法一、实验原理考马斯亮蓝(CoomassieBrilliantBlue)法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量测定微量蛋白浓度快速、灵敏的方法。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。目前，这一方法是也灵敏度最高的蛋白质测定法之一。考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰(lmax)的位置，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。二、优缺点优点：（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质-染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和需要严格地控制时间。（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。缺点（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g-球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、TritonX-100、十二烷基硫酸钠(SDS)等。三、试剂与器材1、试剂考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G-250100mg溶于50mL95%乙醇中，加入100mL85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000mL。2、标准和待测蛋白质溶液（1）标准蛋白质溶液结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用0.15mol/LNaCl配制成1mg/mL蛋白溶液。（2）待测蛋白质溶液，人血清，使用前用0.15mol/LNaCl稀释200倍。3、器材试管1.5×15cm（×6）；试管架；移液管管0.5mL（×2）;1mL（×2）;5mL（×1）；恒温水浴；分光光度计。四、操作方法1、制作标准曲线取7支试管，按下表平行操作。摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色。绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。2、未知样品蛋白质浓度测定测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度（mg/mL）。五、注意事项（1）在试剂加入后的5-20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。（2）测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。（3）利用考马斯亮蓝法分析蛋白必须要掌握好分光光度计的正确使用，重复测定吸光度时，比色杯一定要冲洗干净，制作蛋白标准曲线的时候，蛋白标准品最好是从低浓度到高浓度测定，防止误差。BCA法一、实验原理BCA检测法是Lowry测定法的一种改进方法。与Lowry方法相比，BCA法的操作更简单，试剂更加稳定，几乎没有干扰物质的影响，灵敏度更高（微量检测可达到0.5μg/ml），应用更加灵活。蛋白质分子中的肽键在碱性条件下能与Cu2+络合生成络合物，同时将Cu2+还原成Cu+。二喹啉甲酸及其钠盐是一种溶于水的化合物，在碱性条件下，可以和Cu+结合生成深紫色的化合物，这种稳定的化合物在562nm处具有强吸收值，并且化合物颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。故可用比色的方法确定蛋白质的含量。二、该方法的优点(一)操作简单，快速，45分钟内完成测定，比经典的Lowary法快4倍且更加方便；(二)准确灵敏，试剂稳定性好，BCA试剂的蛋白质测定范围是20-200μg/ml，微量BCA测定范围在0.5-10μg/ml。(三)经济实用，除试管外，测定可在微板孔中就进行，大大节约样品和试剂用量；(四)抗试剂干扰能力比较强，如去垢剂，尿素等均无影响。三、实验材料

1.实验器材

721分光光度计；恒温水浴槽；移液管；微量进样器；试管架和试管。

2.实验试剂

(1)BCA试剂的配制①试剂A，1L：分别称取10gBCA(1%)，20gNa2CO3·H2O(2%)，1.6gNa2C4H4O6·2H2O(0.16%)，4gNaOH(0.4%)，9.5gNaHCO3(0.95)，加水至1L，用NaOH或固体NaHCO3调节pH值至11.25。②试剂B，50ml：取2gCuSO4·5H2O(4%)，加蒸馏水至50ml。③BCA试剂：取50份试剂A与1份试剂B混合均匀。此试剂可稳定一周。

(2)标准蛋白质溶液：称取40mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水中并定容至100ml，制成400μg/ml的溶液。

(3)样品溶液：配制约50μg/ml的牛血清白蛋白溶液作为样品。四、实验方法方法一：96孔板1.配制BCA工作液：根据标准品和样品数量，按50体积试剂A，1体积试剂B配制适量BCA工作液。充分混匀。2.将蛋白标准品按0μL，1μL，2μL，4μL，6μL，8μL，10μL加入96孔板的蛋白标准品孔中。加灭菌双蒸水补足到10μL。取10μL待测样品加入96孔板的待测样品孔中。每个测定要做2～3个平行。3.向待测样品孔和蛋白标准品孔中各加入200μLBCA工作液（即样品与工作液的体积比为1:20），混匀。4.37℃温浴30min。冷却至室温。5.酶标仪562nm波长下测定吸光度。6.制作标准曲线。从标准曲线中求出样品浓度。方法二：试管法1.配制工作液：根据标准品和样品数量，按50体积试剂A，1体积试剂B配制适量BCA工作液，充分混匀。工作液配制的量要与测定所用的比色杯对应。每个测定要做2～3个平行。本处列举的比色体系所用的是0.5mL的比色杯。如比色杯规格不同，体系需要放大到实验将采用的比色杯准确读数所需要的体积。2.BSA标准品和样品的准备：样品用水或其它不干扰显色反应的缓冲液配制，使待测定的浓度位于标准曲线的线性部分。每个反应准备3个平行测定。标准曲线一般5~6个点即可。根据样品的估测浓度确定各点的具体浓度。稀释BSA时可以用水或与样品一致的溶液。如待测样品的浓度约为200μg/mL，可按下表的次序加入BSA标准品、样品及BCA工作液。3.取适量体积的标准蛋白，以蛋白液：工作液=1:20的比例混匀。37℃温浴30min。冷却至室温。4.将样品与标准品在562nm波长下测定吸光度。紫外分光光度计法一、实验原理这种方法是在280nm波长，直接测试蛋白。选择Warburg公式，光度计可以直接显示出样品的浓度，或者是选择相应的换算方法，将吸光值转换为样品浓度。蛋白质测定过程非常简单，先测试空白液，然后直接测试蛋白质。从而显得结果很不稳定。蛋白质直接定量方法，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操作简单；但是容易受到平行物质的干扰，如DNA的干扰；另外敏感度低，要求蛋白的浓度较高。二、结果计算（1）简易经验公式蛋白质浓度(mg/ml)=[1.45*OD280-0.74*OD260]*Dilutionfactor（2）精确计算通过计算OD280/OD260的比值，然后查表得到校正因子F，再通过如下公式计算最终结果：蛋白质浓度(mg/ml)=F*(1/d)*OD280*D其中d为测定OD值比色杯的厚度D为溶液的稀释倍数

蛋白质的定量测定对重组蛋白进行生物化学，生物物理和结构的表征分析之前，需要精确测定纯化后的蛋白浓度。蛋白质浓度测定的准确性不仅对于酶动力学、蛋白质相互作用等基础研究有重要影响，检测数据的可重复性在工业生产中尤其重要。随着DNA重组技术的不断发展，利用不同的表达系统可以获得各种目的蛋白质，但选择不同的系统的蛋白质的表达量有高有低，因此选择合适的方法测定重组蛋白质的浓度显得极其重要。常用的蛋白质定量检测方法有UV吸收法，BCA法，Brandford和Lowry法等，但这些方法并不具有普遍适用性，因此研究人员需要根据待测样品量，氨基酸种类等特性选择合适的检测方法。本文主要介绍了原核表达系统获取的重组蛋白相关的定量检测技术。表1不同蛋白质定量检测方法比较

基于染料的测定BCA、Lowry和Bradford是实验室估计目标蛋白质总量或浓度的常用方法。这些方法依赖于导致颜色变化的化学反应，其颜色变化强度在特定波长下被读取为输出的值。例如，BCA法检测是利用某些氨基酸能在碱性条件下将Cu2+还原为Cu+，从而产生紫色的二喹啉甲酸，在波长562nm处发射峰最大。同样，Lowry法的发射峰在750nm处，而在Bradford法中，波长从465nm变为595nm。尽管这些检测方法有许多优点，包括廉价和快速（3小时内），但由于方法本身的局限性限制了它们的普遍应用。基于染料的测定方法依赖于化学反应，因此在具体的实验中，蛋白质所处的环境和氨基酸的组成决定了测量的有效性。此外，比色法的准确度取决于标准品的校准，因此这些合理选择标准品对于任何定量实验都至关重要。检测的有效性取决于下述几点：确保待测蛋白质可以与检测中使用的染料结合。待测蛋白和标准品应具有相似的氨基酸组成。某些物质（盐和其他添加剂）可能会产生干扰而影响准确测定。例如，用于蛋白质稳定剂的聚乙二醇(PEG)，可能会通过空间位阻起到阻遏作用。某些蛋白质以分子量小的以非极性氨基酸为主（例如胶原蛋白）与染料结合能力较低，因此对显色不太灵敏。相反，如果使用与染料结合能力高的蛋白质（如BSA）进行校准，则待测蛋白质的含量会被低估。考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法首先由Bradford建立，在酸性pH下，带负电荷的染料考马斯亮蓝G-250优先与蛋白质中的某些氨基酸（精氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸）结合并形成稳定复合物，复合物在595nm处有最大吸收波长。Brandford法的局限性在于大部分信号来源于染料与精氨酸残基的相互作用，因此该方法具有蛋白序列特异性，其结果可能因不同的蛋白质而异。图1Bradford法检测示意图Lowry法检测Lowry法原理：第一步是在碱性环境中蛋白质可以将Cu2+还原为Cu+（双缩脲反应）形成铜-蛋白质络合盐；第二步是放大反应，其中Folin-Ciocalteu试剂（活性成分是磷钼酸和磷钨酸的混合物）被还原可在750nm发出强烈的蓝色。这种方法也非常依赖于某些特定氨基酸的存在，包括酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸和组氨酸，因此不同的蛋白质样品可能会出现颜色变化的差异。图2Lowry法检测示意图BCA法检测二喹啉甲酸(Bicinchoninicacid，BCA)法的原理与Lowry法相似的原理（将二价铜离子还原为一价铜离子），只是BCA试剂代替了Folin-Ciocalteu。BCA法涉及的化学反应更稳固，对干扰物的耐受性更好，灵敏度更高，误差更小，被还原的Cu+（蛋白质还原Cu2+所得）与BCA溶液的相互作用形成明亮的紫色溶液，该溶液可在500-570nm的波长下进行测量。图3BCA法检测示意图紫外光谱吸收其原理是测量蛋白质在280nm波长下的吸收，主要是芳香族氨基酸——酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸对紫外的吸收。由于苯丙氨酸的吸收较低，因此其他两种芳香族氨基酸的数目对测量的准确性起着关键作用。该方法不适用于芳香族氨基酸含量低的蛋白质检测。然而，由于操作简单并且不需要标准品，该方法被广泛使用。目的蛋白质的纯度分析在对蛋白质进行下一步的体外分析之前，除了知道纯化后蛋白质的准确浓度外，确定其纯度也同样重要，因为用于结构和生物物理研究的蛋白质大多数纯度需要>95%。鉴定纯化后蛋白质样品纯度最简单、方便和广泛使用的方法之一是十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）。蛋白纯度分析——SDS图4蛋白质样品在SDS凝胶中电泳的示意图实验流程:（1）清洁和组装玻璃板，用夹具固定，加水检查是否漏液；如果漏液，需重新组装。（2）倒去水份，制备表中所述的合适浓度的分离胶溶液，并将溶液添加至玻璃板距顶端2cm处。等待其凝固（约30分钟）。可在溶液顶部加入无水乙醇避免气泡产生。（3）如表11.4所示，制备合适体积的浓缩胶，倒在分离胶的顶部，插入梳子，等待胶凝固。（4）将玻璃胶板转移至电泳槽，取下梳子，向电泳槽中加入1XSDS电泳缓冲液，上样，并在适当条件下电泳。（5）电泳结束后，对凝胶进行染色与脱色，观察蛋白质和其他杂质。表2分离胶组成表3浓缩胶组成

实验前的注意事项1.选择微孔板还是比色皿：样品数目多或样品量少时，选择微孔板进行检测，为了尽量避免实验误差需要进行复孔或三孔实验。在使用石英板检测时应小心操作，防止板子出现划痕。样品数目少则可以选择比色皿，用紫外吸收进行测定。比色皿测定时选择双光束仪器测量，其中参考池用于空白校正，使用之前用适当的溶液对比色皿进行清洗并且干燥以防止影响实验精度。2.干扰物质的影响：在蛋白质纯化或存放的过程中可能会伴随着某些特定的副产品，如咪唑、DTT、甘油等，因此在检测之前必须了解每种检测方法对此类试剂或添加剂的耐受程度，以及需要确定是否在进行蛋白质浓度的