电针对sd大鼠脊髓背角广动力型神经元激活的影响

电针对sd大鼠脊髓背角广动力型神经元激活的影响

针灸和艾灸的原始功能单位不同，因此在关节和肠道之间形成了相对特定的联系。当内脏处于疾病状态时,体表某些穴位或部位可出现各种敏化现象,这种敏化可能是热敏、痛敏、压敏等感觉的变化,也可能是临床上通过医生的诊断观察到穴位处丘疹、凹陷以及结节状或条索状物等形态特征表现。针刺体表穴位对内脏的感觉和运动功能具有特异性调整功效,因此,体表穴位和内脏存在功能和状态的特异性联系。而随着疾病的痊愈,这种敏化现象减弱乃至消失,说明穴位的功能活动是一个动态的过程。当内脏处于疾病状态时,穴位反应和治疗内脏疾病的功能可以增强。为了探讨内脏处于生理和病理的不同状态时,体表穴位功能和敏感程度的动态变化和机制,本研究观察了给予大鼠伤害性内脏扩张刺激后,体表穴位电针刺激对脊髓背角广动力型(widedynamicrange,WDR)神经元激活效应的影响,为揭示穴位功能和敏感程度的动态变化过程及其脊髓机制提供科学依据。1材料和方法1.1实验动物及许可证:scxk-军2007-400健康成年Sprague-Dawley雄性大鼠22只,体质量250~300g,清洁级,由军事医学科学院实验动物中心提供,许可证号:SCXK-(军)2007-004。动物实验前禁食12h,不禁水,实验过程中对动物的处置遵循2006年科技部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》。1.2皮肤损伤的预防给予动物10%的乌拉坦(1.2g/kg)腹腔注射麻醉,然后行气管插管术。于背部正中线切开腰部皮肤,暴露L1-3节段脊髓,移至立体定位仪(DGY-79A,吉林长春),在显微镜下剪开硬脊膜,用游丝镊撕开软脊膜,然后用38℃石蜡油覆盖,以免脊髓干燥。最后腹腔注射三碘季胺酚,接通呼吸机进行人工呼吸。实验全过程中动物体温通过反馈型加热仪(瑞沃德CL-8)控制在37℃左右。1.3培育特殊神经元采用充灌5%氯化钠和滂胺天蓝溶液的玻璃微电极(阻抗约8~12MΩ),在微电极操纵器(SM-21,日本成茂)控制下根据WDR神经元的三维空间坐标将记录电极插入脊髓背角,寻找所需神经元。WDR神经元的坐标定位为:脊髓后正中裂旁开0.5~1.5mm,脊髓表面下500~1500μm。神经元放电信号经微电极引入8301微电极放大器及Power-Lab电生理记录系统,进行神经元放电信号的放大和处理。1.4内脏伤害性预防内脏伤害性刺激采用直结肠扩张(colorectaldistention,CRD)法,将一个长约4~6cm的气囊经肛门插入直结肠,插入的深度约为5~6cm,内脏伤害性传入由插入直结肠内的气囊充气1min来实现。为避免造成直结肠壁和肛门的刺激,置入时在气囊上涂抹温热的石蜡油。插入后气囊部分与肛门距离0.5cm,避免刺激肛门。实验时气囊扩张压力控制在80mmHg(1mmHg≈0.133kPa),为避免出现过度刺激造成直结肠敏感化,重复CRD刺激间隔5min以上。电针刺激通过刺激器(88-102G,日本光电)输出。频率:15Hz;持续时间:2ms;电针强度:1mA、4mA、7mA、10mA。电针穴位选择与直结肠同神经节段的同侧“足三里”穴区。1.5ddr神经元对电针的激活反应记录到放电信号稳定的神经元后,首先检查神经元对体表非伤害性刺激(触摸、刷毛、有齿镊夹夹皮)的反应,观察其外周感受野的分布范围。然后试验这些神经元对伤害性刺激(40~60mmHgCRD、3mA电针刺激同侧“足三里”穴区)的反应,若神经元对伤害性和非伤害性刺激均发生反应,就被定义为WDR神经元,随即进入记录程序。一个标准的记录程序设定为:先记录10s的神经元背景活动,然后给予30s电针刺激,之后停止电针刺激,待神经元放电恢复后,给予持续1min的80mmHgCRD刺激,之后停止CRD,待细胞放电恢复后,再给予30s电针刺激。观察CRD刺激前后,在相同强度和相同穴位电针刺激条件下,WDR神经元对电针的激活反应是否发生变化。在实验记录过程中,为了避免重复电针刺激和CRD刺激造成实验的干扰,每个记录周期随机给予一种强度电针刺激。若WDR神经元对电针和CRD刺激发生强敏化反应,停止刺激后不能恢复背景放电,该神经元则被剔除。1.6实验大鼠脑电极单细胞记录结束后,由刺激器输出20μA的负向直流电20~30min,通过玻璃微电极将滂胺天蓝电极液导入大鼠脑组织,以标记记录位置。将动物经心脏灌流固定,取脊髓组织做冰冻切片,HE染色观察,参考大鼠脑立体定位图谱(Paxinos&Watson,2007),确定滂胺天蓝标记的微电极记录位置。1.7电针和crd刺激前后神经元/放电计数统计用Power-Lab计算机数据采集系统、Chart5.0分析软件和SPSS13.0数据统计软件进行数据整理分析。计算电针和CRD刺激前后,神经元每秒的放电个数和激活率,数据表示为均数±标准误(ue0af±sue0af)。CRD刺激前后,电针对神经元激活效应的比较采用配对t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1神经元自转体wdr实验在22只大鼠共记录到52个WDR神经元,有12个神经元因对电针和CRD刺激发生强敏化反应不能恢复背景放电被剔除。图1A为本项实验中记录的部分WDR神经元在脊髓背角的滂胺天蓝定位。大部分标记的神经元位于脊髓板层的第Ⅳ和Ⅴ层,小部分位于第Ⅰ、Ⅵ板层。部分L1-3节段脊髓背角WDR神经元的外周感受野分布范围参见图1B,电极插入部位为脊髓背角的右侧,可见其感受野主要分布于记录神经元同侧的下肢、会阴、臀部、尾巴等部位,此部位分布有大鼠的“后三里”穴,即以下所述的“足三里”穴。2.2crd前后神经元放电活动的激活效应将记录到的40个WDR神经元随机分为5组,每组8个神经元。首先在8个WDR神经元观察了80mmHgCRD刺激对WDR神经元的激活反应,神经元放电频率从背景时的(2.78±0.62)个/s增加到CRD时的(8.95±1.89)个/s峰电位,其激活的百分率为(209.85±45.81)%,统计学结果显示差异有统计学意义(P<0.001),表明80mmHgCRD刺激对WDR神经元有非常明显的激活反应,为内脏伤害性刺激。在CRD刺激引起WDR神经元稳定激活之后停止CRD,待神经元放电活动恢复后,再给予穴位单纯电针刺激,在一定电针强度范围内,电针对WDR神经元放电活动的激活效应会进一步增加(图2、图3),表明在给予大鼠持续的伤害性CRD刺激造成内脏伤害性损伤后,穴位的电生理学功能和敏感程度发生了敏化。在8个WDR神经元上观察了1mA强度电针对神经元放电活动激活效应的影响。CRD前,神经元放电从背景活动时的(2.56±0.61)个/s增加至(2.99±0.59)个/s峰电位,而CRD后,电针使神经元放电进一步增加至(8.17±1.08)个/s峰电位。统计学结果显示,CRD前,电针对WDR神经元放电活动有轻微的激活效应,其激活率为(18.12±13.56)%(P<0.05),但是,CRD后电针对WDR神经元放电活动有显著的激活效应,其激活率为(226.78±39.59)%(P<0.01),CRD后的电针效应和CRD前的电针效应相比,其激活效应进一步增加了(177.92±32.17)%(P<0.001)。在8个WDR神经元上观察了4mA强度电针对神经元放电活动激活效应的影响。CRD前,神经元放电从背景活动时的(2.68±0.59)个/s增加至(6.64±1.00)个/s峰电位,而CRD后,电针使神经元放电进一步增加至(10.10±1.65)个/s峰电位。统计学结果显示,CRD前后电针对WDR神经元均有非常显著的激活效应,其激活率分别为(152.38±36.19)%(P<0.001)、(282.80±47.54)%(P<0.001),CRD后的电针效应和CRD前的电针效应相比进一步增加了(52.95±19.67)%(P<0.01)。在8个WDR神经元上观察了7mA强度电针对神经元放电活动激活效应的影响。CRD前,神经元放电从背景活动时的(2.75±0.35)个/s增加至(9.02±1.33)个/s峰电位,而CRD后,电针使神经元放电进一步增加至(12.07±1.38)个/s峰电位。统计学结果显示,CRD前后,电针对WDR神经元的激活率分别为(232.21±49.74)%(P<0.001)、(343.06±58.35)%(P<0.01),CRD后的电针效应和CRD前的电针效应相比也进一步增加了(34.86±15.16)%(P<0.01)。在8个WDR神经元上观察了10mA强度电针对神经元放电活动激活效应的影响。CRD前,神经元放电从背景活动时的(2.77±0.38)个/s增加至(11.82±1.33)个/s峰电位,CRD后,电针使神经元放电增加至(12.04±2.12)个/s峰电位。统计学结果显示,CRD前后,电针对WDR神经元的激活率分别为(331.54±61.89)%(P<0.01)、(338.62±80.04)%(P<0.01),但CRD刺激前后电针的激活效应没有明显变化(P>0.05)。以上结果表明,内脏伤害性扩张刺激可以敏化脊髓背角的WDR神经元,使其对来自体表穴位的电针刺激产生更强烈的反应,脊髓WDR神经元在内脏伤害性损伤后功能易化导致了穴位功能敏化的动态变化;但是当电针刺激强度达到一定程度时,穴位功能敏化效应达到一个平台期。3穴位功能的动态性中医学认为穴位、经络、脏腑是一个有机的整体,穴位是沟通经络-脏腑联系的关键环节,与内脏相关的穴位既可以治疗相应内脏的疾病,同时,也可以反映相应内脏的疾病,正如《灵枢·九针十二原》所述:“五脏有疾也,应出十二原,而原各有所出,明知其原,睹其应,而知五脏之害矣。”说明穴位是与相应脏腑经络之气相通,并随之活动而变化的反应点。随着人们对穴位认识的逐渐深入,近年有学者提出穴位的大小和功能强弱可随内脏功能变化而发生变化的动态概念,认为当内脏处于疾病状态时,穴位反应和治疗疾病的功能可以增强,穴位的这种特性被认为是敏化现象。中国中医科学院针灸研究所最初采用形态学方法对穴位敏化现象进行了一系列研究,实验观察到急性胃黏膜炎性反应损伤模型大鼠体表神经源性炎性反应点呈节段性分布,与“脾俞”“胃俞”等穴位具有高度相关性,而且和炎性反应的过程相关,呈动态分布,在正常状态很少出现,并随着炎性反应的自愈而逐渐消退。临床研究也观察到胃溃疡患者在体表相关反射区有明显压痛点,主要集中在腹部足阳明胃经的不容、梁门、滑肉门段,及背部的脾俞、胃俞、胃仓区域。这些研究结果表明穴位可能不是一个静态的点,而是一个动态的功能单位,在内脏疾病状态下,体表沉寂的穴位可以被激活,穴位的敏感性和功能性更强。为了探讨穴位功能动态性的科学基础,本研究给予大鼠伤害性内脏扩张刺激后,观察穴位电针刺激对脊髓背角WDR神经元激活效应的影响,结果表明内脏伤害性扩张刺激可以易化穴位刺激对脊髓背角的WDR神经元的激活作用,当电针强度在1~7mA时,CRD刺激后,电针对WDR神经元的激活效应明确增强,由此验证了穴位功能的动态性过程。以往的研究也表明,内脏或深部组织的传入冲动可以敏化脊髓背角的躯体-内脏会聚神经元,从而使该神经元对来自体表的传入产生更强烈的反应。如:输尿管结石引起的牵涉性肌肉痛觉过敏的动物,其具有背景放电的脊髓细胞数目及其背景放电的频率都显著高于正常的对照动物;膀胱的化学刺激后,对膀胱神经电刺激起反应的脊髓背角神经元的背景放电也明显增加;食管和结肠的炎性反应则可导致脊髓神经元的反应阈值降低。上述结果表明内脏伤害性传入可以易化来自体表的传入。这种易化现象在脊髓上中枢也存在,在丘脑腹后外侧核(VPL),大多数VPL神经元对CRD和皮肤振动触觉刺激均发生以激活为主的反应,超过半数以上的VPL神经元对皮肤振动的反应还能被预先的CRD条件刺激所加强。因此,穴位的功能在内脏疾病状态下发生敏化的动态过程与体表传入和内脏伤害性传入在脊髓或/和脊髓上中枢会聚易化过程有关。我们前期研究观察到内脏病变可以影响体表穴位功能,随着内脏伤害性刺激强度的增加,对穴位的敏化效应进一步加强,呈现出明显的量效敏化关系。但是,本研究观察到当电针刺激强度达到10mA时,CRD刺激前后电针对WDR神经元的激活效应差异无统计学意义,说明当电针刺激强度达到一定程度时,穴位功能敏化达到平台效应。这种穴位敏化特点与脊髓WDR神经元对伤害性刺激的反应特点密切相关。以往的研究证实脊髓WDR神经元对体表和内脏的分级刺激可发生分级的反应,但是当刺激量达到一定程度时,神经元的放电活动达到一个平台期,其对体表和内脏刺激的反应不再随刺激量的