步长脑心通对慢性脑缺血大鼠认知功能及神经细胞凋亡的影响

步长脑心通对慢性脑缺血大鼠认知功能及神经细胞凋亡的影响

血管性脑瘫（vd）是由多种因素引起的脑瘫障碍引起的瘫痪总称。VD患者有明显的记忆、计算、思维、定向和判断等能力障碍,给家庭和社会造成沉重的负担,因此成为世界老年脑病研究的热点和难点。目前研究认为,长期慢性脑缺血是VD形成的重要因素之一。以往本课题组的研究已证明慢性持续性脑缺血可以引起神经细胞凋亡而致进行性认知功能障碍。步长脑心通是由水蛭、地龙等组方的复方中药制剂,传统医学认为其可以促进血液循环,通络镇痉。临床上曾有人应用步长脑心通治疗VD引起的认知功能障碍且有疗效,但机制尚不清楚。本研究通过观察步长脑心通对慢性脑缺血引起的VD大鼠神经细胞凋亡的影响,探讨步长脑心通防治慢性脑缺血致VD的疗效和机制,为临床治疗VD提供实验依据。1大鼠记忆功能测定1.1动物与药物选用雄性Wistar大鼠,鼠龄3~5月,体重300~350g,由长春市高新技术开发区医学动物实验研究中心提供。步长脑心通生药粉由咸阳步长制药有限公司提供。1.2试剂与仪器TUNEL染色试剂盒购于迈新公司,Bcl-2试剂盒购于北京鼎国公司。Morris水迷宫由中国医学科学院治疗所生产。Olympus照相显微镜产于日本。HPIAS-1000高清晰彩色病理图文分析系统(同济大学)。1.3动物模型制备和分组及给药方法采用双侧颈总动脉永久结扎方法制备慢性前脑缺血大鼠模型。将造模成功的Wistar大鼠随机分为1月和2月模型对照组(模型+盐水)及给药组(模型+步长脑心通),另设1月和2月正常对照组,每组6只大鼠。给药组大鼠自手术当日起,给予步长脑心通生药粉0.15g·d-1,溶于3mL生理盐水1次·d-1灌胃。正常对照组和模型对照组大鼠予生理盐水3mL·d-1灌胃。1.4记忆功能的测定采用Morris水迷宫法进行大鼠记忆功能的测定。Morris水迷宫为一不锈钢的圆形水池,直径130cm,高50cm。池壁标明4个入水点,由此将水池等分为4个象限,任选其中1个象限,正中放置1个直径11cm、高29cm的平台。所有大鼠在分组前都进行Morris水迷宫的定位航行试验训练:历时4d,每天上下午各2次,将大鼠面向池壁分别从4个入水点放入水中,记录其在3min内寻找到并爬上平台的时间即逃避潜伏期(escapelatency)。如果大鼠在3min内未找到平台,则由实验者用手牵引其至平台上,让大鼠停留10s,再放回笼中,以潜伏期小于180s为学会游迷宫的标准。证实各大鼠间无明显智能差异,再进一步随机分组制备模型。分别在术后1、2月重新进行定位航行试验,大鼠每次在3min内寻找到并爬上平台的时间为大鼠的记忆成绩,每日2次,连续4d,计算平均成绩。1.5HE和Bcl-2免疫组织化学染色各组大鼠用4%多聚甲醛灌注断头取脑,置于4%多聚甲醛固定24h,常规石蜡包埋,5μm厚连续切片。取相同层面切片分别HE染色和Bcl-2免疫组织化学染色。Bcl-2免疫组织化学染色采用SP法,DAB染色。在高倍镜下观看细胞形态和Bcl-2阳性细胞表达。用病理图文分析系统进行图像分析测定Bcl-2染色阳性信号的平均灰度值(灰度值与表达强度成反比)。1.6原位末端标记法(TUNEL)染色取切片分别经过氧化氢、复合消化液处理,加含末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)、地高辛标记的dUTP反应液,37℃孵育2h,连接生物素化抗地高辛抗体,DAB显色,苏木素复染。在高倍光镜下,计算凋亡指数,即每张片选取5个阳性细胞数最多的高倍视野,计算出平均阳性细胞百分数并用病理图文分析系统进行图像分析。1.7统计分析数据均以x¯±sx¯±s表示,采用SPSS10.0软件进行统计分析,组间比较采用t检验。2结果2.1给药后大鼠逃避刑期比较经过训练已学会游迷宫的大鼠在双侧颈总动脉结扎后,1月和2月模型对照组及给药组大鼠逃避潜伏期较正常对照组均明显延长(P<0.01);给药组大鼠逃避潜伏期则明显低于模型对照组(P<0.01),见表1。2.2大鼠锥体细胞考虑1月和2月模型对照组大鼠海马区多个神经元出现缺血性改变,且2月组大鼠锥体细胞缺血改变重于1月组,不同时期给药组大鼠锥体细胞缺血改变明显轻于模型组。正常对照组大2.3不同给药组性细胞的bcl-2表达水平①凋亡细胞检测结果:TUNEL法检测凋亡细胞,光镜下阳性细胞呈棕黄色,而阴性细胞呈淡蓝色。结果显示,模型对照组大鼠脑组织皮质及海马分布大量的阳性细胞,其凋亡细胞数目明显多于给药组(P<0.05)(见表2)。正常对照组未见凋亡细胞(图1A,见封二);1月模型对照组凋亡细胞较给药组多(图1B和C,见封二);2月模型对照组可见大量凋亡细胞,给药组凋亡细胞较少(图1D和E,见封二)。②Bcl-2表达水平:光镜下观察,Bcl-2蛋白免疫组化阳性细胞表现为在神经细胞胞浆和/或细胞膜内表达棕黄色细颗粒,阳性神经细胞胞体大,多角形,有的可见较长突起,着色深浅不一。结果显示,给药组大鼠Bcl-2阳性细胞灰度平均值明显低于模型对照组(P<0.05)(见表3)。3抗凋亡作用机制VD是由于脑血管疾病引起的以学习记忆障碍为主要表现的一种疾病,病因目前尚不清楚,近年来发现慢性持续性脑血流量下降在VD发病机制中起重要的作用。本实验应用双侧颈总动脉结扎方法制作VD模型,造成大鼠脑组织慢性持续性缺血,应用Morris水迷宫定向航行实验证实,随着缺血时间的延长,大鼠出现持续性认知功能障碍。本实验通过TUNEL染色证实了慢性缺血可以引起神经细胞凋亡,且随着缺血时间的延长大鼠出现持续性认知功能障碍,说明细胞凋亡参与慢性缺血致VD导致的认知功能障碍的过程。细胞凋亡时伴随着一些凋亡促进或抑制基因的表达,这些基因通过对细胞凋亡发生过程的干预而对凋亡进行调控。Bcl-2是一种抑制细胞凋亡的基因,其抗凋亡的机制目前尚不清楚,Kluck等认为,Bcl-2可能是通过抑制细胞色素C从线粒体外溢,从而阻断细胞凋亡发生。另有报道,Bcl-2可能通过减少神经元中氧化反应物质的形成、抑制钙超载、调控细胞信号传导等途径而发挥抗凋亡作用。本实验通过检测Bcl-2的表达水平,发现Bcl-2的表达水平越高,细胞凋亡程度越轻。步长脑心通是由咸阳步长制药有限公司研制和生产的中成药。该药由黄芪、丹参、当归、川芎、红花、乳香、没药、桂枝、全蝎、地龙及水蛭等组成,具有益气活血、化瘀通络之功效。本实验采用步长脑心通对慢性脑缺血致VD大鼠模型进行干预,Morris水迷宫实验结果表明,不同时间点给药组大鼠逃避潜伏期均低于手术组,说明步长脑心通可延缓认知障碍的进行性进展。本实验结果还显示,给药组大鼠较模型对照组大鼠细胞凋亡率低,同时给药组大鼠较模型对照组大鼠Bcl-2表达增加,而1月和2月给药组大鼠Bcl-2的表达差异无显著性(P>0.05),说明步长脑心通可以使