冬虫夏草生长量测定的药代动力学研究冰片对川芎嗪促吸收作用的研究

冬虫夏草生长量测定的药代动力学研究冰片对川芎嗪促吸收作用的研究

四川巴比特（2、3、5、6-硝基吡啶）是从波形科植物川香（liguansiju相似）的根中分离提取的碱性单体，具有抗血小板聚集和对聚集血小板的解聚作用。对小动脉收缩有改善的微循环，增加脑血流量，导致血液和静脉阻塞形成和溶血血栓形成。但是川芎嗪极易升华(22℃,常压)且在水中溶解度较小,为了便于保存和应用,将其制成磷酸盐和盐酸盐。磷酸川芎嗪的熔点较高(173~177℃),且不易升华,较为稳定,故本研究选择磷酸川芎嗪(tetramethylpyrazinephosphate,TMPP)作为模型药物。冰片(borneol,龙脑)为龙脑科植物龙脑香树脂的加工品。《本草纲目》记载,冰片具有“通诸窍、散郁火”之功效。在许多中成药中常作为“药引”,以增加其他药物的治疗效果。作者前期研究已表明,小鼠灌服磷酸川芎嗪和冰片后,冰片能提高磷酸川芎嗪的生物利用度,并能增加其在脑组织的浓度。天然冰片主要含右旋龙脑(D-borneo1),目前冰片已有人工合成产品,合成冰片除含右旋龙脑外,还含有异龙脑。有研究表明,假设在两种冰片的毒性相当的情况下,天然冰片可以与合成冰片互相替代使用。目前大多中成药均使用合成冰片。本文研究的目的在于通过大鼠在体肠循环及整体动物实验进一步说明冰片对磷酸川芎嗪的促吸收作用,并以维拉帕米(verapamil)作为对照,初步研究了冰片的作用机制。方法的回收率与精密度试验条件药品磷酸川芎嗪(TMPP,北京燕京制药厂纯度99.8%),冰片(borneol,国药集团化学试剂有限公司,纯度99.4%),维拉帕米(verapamil,天津中央药业,纯度100.4%),环孢素A(成都宇洋高科技发展有限责任公司,纯度98.0%),甲醇(色谱纯,江苏汉邦科技有限公司)。仪器HW色谱工作站,日本岛津LC-10AT高压泵,日本岛津SPD-10A紫外检测器。动物雄性SD大鼠,体重200~300g,中国药科大学动物房提供。可自由饮水和饮食,实验前禁食24h。肠循环液中TMPP含量的测定(1)吸收波长的选择将TMPP溶于50%甲醇中,在200~400nm波长内进行紫外扫描,结果表明TMPP在295nm处有最大的吸收峰,故最后选定检测波长为295nm。(2)色谱条件色谱柱:DiamonsilC18(4.6mm×250mm,5μm);流动相:甲醇-水=50∶50(v/v);流速:1mL·min-1;柱温:40℃;进样量:20μL。(3)方法专属性分别取空白循环液,TMPP对照液及供试液进样,在上述色谱条件下测定(图1)。由图1可见TMPP对照液的tR=7.478min,供试液的主峰保留时间与TMPP对照液一致。空白循环液在此条件下无干扰。(4)标准曲线的制备精密称取TMPP适量,置100mL量瓶中,用pH6.8Kreb-Ringer’s缓冲液溶解,稀释至刻度,得到质量浓度为50μg·mL-1的贮备液。分别精密移取贮备液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0mL置10mL量瓶中,用pH6.8Kreb-Ringer’s缓冲液稀释至刻度,摇匀,取20μL进样。以药物浓度(C)为横坐标,峰面积(A)为纵坐标进行线性回归,得标准曲线方程:A=7249.6C+4199.2(R2=0.9998),线性范围:5~50μg·mL-1。高、中、低3个浓度的平均回收率分别为99.54%,98.76%和99.23%,日内精密度RSD分别为0.12%,0.48%和0.17%,日间精密度RSD分别为0.77%,0.32%和0.48%,均符合要求。在体肠循环实验方法将禁食24h(自由饮水)的大鼠称重,腹腔注射戊巴比妥钠溶液(40mg·kg-1),背位固定在手术台上,沿腹中线切开约3cm,对考察的部位进行插管后结扎。用37℃的生理盐水将肠道内容物冲洗干净,待排掉生理盐水后,将流速调至1.0mL·min-1,用50mL的供试液进行循环。2h后停止回流,用Kreb-Ringer’s缓冲液冲洗各个回流管道,用100mL量瓶接收冲洗液,合并50mL量瓶中剩余供试液,并用Kreb-Ringer’s溶液定容,经0.45μm滤膜过滤,取20μL进样,记录样品的峰面积。撤掉装置后,测定各个循环肠段的面积。实验研究的肠段区间皆取10cm,各肠段区间如下:十二指肠上自幽门1cm处开始;空肠段离幽门15cm处开始;回肠段自盲肠上行20cm处开始;结肠段从盲肠后段开始。数据处理单位面积药物吸收量(μg·cm-2)=[C0×50-C2×100]/S其中:C0、C2分别为原药液和2h后回流液的浓度;S为对应的肠段面积TMPP在血浆中分析方法的建立(1)色谱条件色谱柱:DiamonsilC18(4.6mm×250mm,5μm);流动相:甲醇-水=50∶50(v/v);检测波长:295nm;流速:1mL·min-1;柱温:40℃;进样量:20μL。(2)标准溶液的配制称取TMPP适量,用甲醇溶解稀释至刻度,摇匀,制备成1mg·mL-1的贮备液1,将贮备液1再用甲醇稀释10倍成100μg·mL-1的贮备液2备用。吸取贮备液1和贮备液2适量分别置于10mL量瓶中,分别用流动相稀释至刻度,摇匀,制成药物浓度分别为0.4、2、4、32、60、240、800μg·mL-1的标准溶液。(3)大鼠空白血浆的制备大鼠于眼眶底静脉丛取血约500μL,置肝素化的试管中,10000r·min-1离心5min,分出空白血浆,于-20℃冰箱中保存待测。(4)方法专属性考察取空白大鼠血浆100μL,按以下“大鼠血浆样品处理方法”操作,检测空白血浆、加药血浆和血浆样品,考察色谱分离情况。结果表明,在此液相条件下,血浆中杂质不干扰样品的测定。药物和血浆杂质达基线分离(图2)。TMPP的保留时间约为7.6min。(5)标准曲线的制备取空白大鼠血浆100μL,分别加入各浓度标准溶液5μL,涡旋混匀,配成质量浓度分别为0.02、0.1、0.2、1.6、3.0、12.0和40μg·mL-1的血浆样品,按“大鼠血浆样品处理方法”处理后进样,以浓度(C)为横坐标,峰面积(A)为纵坐标,得标准曲线方程:A=25070C+1693.9(r2=0.9989),线性范围:0.02~40μg·mL-1。高、中、低3个浓度的平均回收率分别为95.68%,94.67%和96.38%。日内精密度RSD分别为1.36%,2.88%和4.51%,日间精密度RSD分别为2.72%,4.18%和4.21%,均符合要求。最低检测限为20ng·mL-1。大鼠血浆样品的处理方法精密移取血浆样品100μL置于1.5mL塑料离心管中,加入pH8.0磷酸盐缓冲液10μL,涡旋3min混匀,加入乙腈150μL,涡旋3min混匀,12000r·min-1离心10min,精密移取上清液20μL进样,根据标准曲线求算血浆样品中磷酸川芎嗪的浓度。给药与取样取18只大鼠禁食12h后随机分成3组,每组6只,TMPP按照3.4mg·kg-1的剂量灌胃给予大鼠。第1组灌胃给予TMPP0.5%羧甲基纤维素钠配成的溶液,第2组将TMPP和维拉帕米的混合物溶于0.5%羧甲基纤维素钠中(维拉帕米剂量为3.4mg·kg-1)灌胃,第3组将TMPP和冰片的混合物混悬于0.5%羧甲基纤维素钠中(冰片剂量为34mg·kg-1)灌胃,给药后5、10、15、20、30、40、60、90、120、240min于大鼠眼眶取血0.5mL,置肝素化的试管中,按照“大鼠血浆样品处理方法”进行处理测定,代入标准曲线计算磷酸川芎嗪的血药浓度。本文采用中国药理学会数学药理专业委员会编写的3p97实用药代动力学计算程序对大鼠血药浓度数据进行药动学解析,其中Cmax和tmax为实测值。采用方差分析进行比较。结果1药物稳定性实验将Kreb-Ringer’s供试液(15μg·mL-1)50mL置于循环装置中,在与实验相同的条件下循环2h,结果表明2h后所得药物浓度为原药物浓度的(99.81±0.23)%(n=3),可认为在实验时间内药物在肠循环液中的稳定性较好,因此可以排除药物稳定性因素及循环装置对药物的吸附性实验结果的影响。2er’s供试液药物浓度测定将空白大鼠的十二指肠,空肠,回肠和结肠各剪取约10cm,将其翻转后分别置于Kreb-Ringer’s供试液(15μg·mL-1)50mL中,于37℃孵化2h,取出肠段后,测定孵育液中的药物浓度,分别为原药物浓度的(99.54±0.41)%,(99.72±0.82)%,(99.26±0.48)%和(99.69±0.11)%(n=3)。可认为大鼠肠壁对药物基本无物理吸附。3药物浓度对tmpp肠吸收的影响采用大鼠在体肠循环实验方法,用pH6.8KrebRinger’s缓冲液分别配制浓度为5、15、50μg·mL-1的供试液,考察药物浓度对TMPP肠吸收的影响。结果见图3。从图3可以看出,在不同浓度条件下,TMPP在4个肠段的单位面积吸收量顺序均为:结肠>十二指肠>空肠>回肠,且随药物浓度的增大各肠段的单位面积吸收量均增加。4ph值对tmpp肠吸收的影响采用大鼠在体肠循环实验方法,分别用pH为5.0、6.8和7.4的Kreb-Ringer’s供试液(15μg·mL-1)分别在十二指肠、空肠、回肠和结肠4肠段进行灌流,考察pH值对TMPP肠吸收的影响。结果见图4。从图4可以看出,溶液偏酸性(pH5.0)时,TMPP的单位面积吸收量较pH6.8和pH7.4的溶液略微有所增加,在十二指肠增加的程度尤为明显。5冰流速对tmpp吸收特性的影响采用大鼠在体肠循环实验方法,用pH6.8KrebRinger’s缓冲液配制质量浓度为15μg·mL-1的供试液,加入冰片,配成冰片质量浓度分别为10、25、50μg·mL-1,考察冰片对TMPP在4个肠段吸收的影响。结果见图5。结果表明,冰片对TMPP在4个肠段的吸收均有促进作用。但冰片的使用并没有改变TMPP的吸收特性,即4个肠段的单位面积吸收量大小顺序依然为:结肠>十二指肠>空肠>回肠。经方差分析,加入冰片质量浓度为10μg·mL-1时,与不加冰片的对照组相比,无显著性差异(P>0.05);加入冰片质量浓度为25和50μg·mL-1时,与不加冰片的对照组相比,均具有显著性差异(P<0.05);但是加入冰片质量浓度为25μg·mL-1与50μg·mL-1的TMPP溶液相比,无显著性差异(P>0.05)。6tmpp在大鼠体内的浓度大鼠灌胃给予TMPP溶液、TMPP与维拉帕米的混合物以及TMPP与冰片的混合物后血药浓度经时过程见图6。结果可见,大鼠灌胃TMPP溶液后,10min即达峰值,峰浓度为(1.87±0.56)μg·mL-1,之后药物浓度迅速下降,给药20min后,TMPP在体内质量浓度已经降到(0.95±0.21)μg·mL-1;而灌胃TMPP和维拉帕米的混合物后,TMPP在大鼠体内的达峰时间为20min,达峰浓度为(2.15±0.58)μg·mL-1,而给药120min后TMPP在体内还有(0.86±0.14)μg·mL-1;灌胃TMPP和冰片的混合物后,TMPP在大鼠体内的达峰时间为30min,达峰浓度为(2.36±0.76)μg·mL-1,而给药120min后TMPP在体内还有(0.61±0.28)μg·mL-1。6.1药代动力学参数不同药物的相互作用在体肠循环实验结果可以看出TMPP随给药浓度的增大而吸收增加,没有吸收饱和现象,初步断定TMPP在大鼠肠道以被动扩散方式吸收,且在4个肠段均有较好的吸收。溶液偏酸性(pH5.0)时,TMPP的单位面积吸收量较pH6.8和pH7.4的溶液略有所增加,这可能与药物本身的弱酸性及溶解度有关。冰片质量浓度分别为10、25、50μg·mL-1时,TMPP十二指肠单位面积吸收量分别是不加冰片的1.15、1.65和1.82倍,空肠单位面积吸收量分别是不加冰片的1.12、1.30和1.59倍,回肠单位面积吸收量分别是不加冰片的1.16、1.31和1.46倍,结肠单位面积吸收量分别是不加冰片的1.09、1.29和1.35倍。结果表明,冰片发挥促吸收作用需要一定的浓度,冰片用量较小时促吸收的效果较小,但是加大冰片的用量,促吸收的效果也没有成等比例的增加。该结果与作者前期小鼠体内研究结果一致。此结果显示,冰片促进了药物在4个肠段的吸收,无明显的靶部位但其发挥促吸收作用需要一定的浓度。Chen等研究表明,先灌胃冰片一定时间后,再灌胃药物,由于冰片的促进作用可以使药物的达峰时间提前,而从本研究的TMPP血药浓度经时曲线可以看出,维拉帕米和冰片分别与TMPP合用后,使药物的达峰时间从10min分别延长至20min和30min,这可能是由于将维拉帕米和冰片分别与药物同时灌胃给药,维拉帕米和冰片被吸收后也需要一定时间才能发挥作用,而药物自身的达峰时间迅速,故合用给药后使得药物达峰时间推后。通过统计矩原理计算得出的AUC数据可以看出,维拉帕米和冰片都促进了TMPP在大鼠体内的吸收,其增加的程度与单独给TMPP相比分别是(1.42±0.14)倍和(1.30±0.11)倍。本文研究中使用的维拉帕米的给药剂量为3.4mg·kg-1,而冰片的给药剂量为34mg·kg-1,由此数据可以看出,达到相似的促吸收效果,冰片所需的剂量远大于维拉帕米,也说明了冰片促药物吸收的作用比维拉帕米弱。当药物穿过肠上皮细胞时药物会在细胞内代谢,肠道内代谢酶系主要是细胞色素P4503A(cytochromeP4503A,CYP3A),维拉帕米是CYP3A的抑制剂;发生转运蛋白的外排作用,主要的外排蛋白有P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)和多药耐药蛋白(MRP2),体外研究P-gp对药物小肠吸收的影响时大多采用的逆转剂为环孢素A和维拉帕米。环孢素A通过与耐药细胞膜上、细胞器或细胞核膜上P-gp竞争结合,抑制其泵出的功能,提高细胞内药物的浓度。维拉帕米发挥抑制P-gp的作用与钙拮抗活性无关,而是与P-gp竞争性的结合,改变药物的亚细胞分布,降低MDR1基因的mRNA水平,从转录水平抑制P-gp的表达;当使用促吸剂时,有的可以打开细胞间紧密连接后增加胞间转运,有的可以改变细胞膜的通透性增加跨细胞转运。整体动物实验结果表明,维拉帕米与TMPP合用后,增加了TMPP的生物利用度。可以推断TMPP在吸收过程中可能也存在CYP3A代谢和P-gp外排的现象,此结果与He等的研究结果一致。而冰片与TMPP合用后,冰片也促进了TMPP在大鼠体内的吸收,说明冰片有可能也是CYP3A和P-gp的抑制剂。从3p97程序对药物的血药浓度经时曲线进行拟合后发现,维拉