土壤微生物的研究进展

土壤微生物的研究进展

土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分，在养分循环和能量流动中起着重要作用（schroter等人，2003）。土壤微生物对外界条件的变化反应敏感,微生物群落结构可以指示土壤肥力的变化(Steenwerthetal.,2002;White&Rice,2009)。作为一项土壤质量指标,土壤微生物在农业可持续发展的研究中具有重要的意义。种植方式的改变会引起土壤肥力的变化。在不同的种植方式下,由于植物种类和人类活动强弱的差异,土壤的物理、化学及生物学性质会发生变化(Calderónetal.,2000)。研究发现,黑土由草地向农田进而向裸地的演变过程中,土壤微生物群落的功能多样性呈下降趋势,植被类型可能是土壤微生物多样性变化的重要推动力之一(孟庆杰等,2008)。耕作能使土壤结构发生改变,降低底物的丰度和均匀度,影响土壤微生物的代谢,降低土壤微生物的多样性(Lupwayietal.2001)。土壤微生物是土壤质量变化的早期预警指标,可以为预测不同种植方式下土壤肥力的变化趋势提供可靠的依据(Zellesetal.,1992)。磷脂脂肪酸是磷脂的构成成分,它具有结构多样性和生物特异性。土壤中磷脂脂肪酸的存在及其丰度可揭示特定生物或生物种群的存在及其丰度。磷脂脂肪酸在细胞死亡后快速降解,故可用来表征微生物群落中“存活”的那部分群体(Zelles,1999)。磷脂脂肪酸分析方法是一种快速、可靠的分析土壤微生物群落结构的方法,通过对磷脂脂肪酸的定量测定,可了解微生物活细胞生物量和土壤微生物群落结构(Bossioetal.,1998)。用磷脂脂肪酸方法检测环境样品中微生物群落,可避免由培养和直接的计数方法引起的问题,与传统方法相比,它能更精确地测定微生物的生物量(Green&Scow,2000)。东北三省拥有我国唯一一条玉米带,与同纬度的美国玉米带、乌克兰玉米带并称为世界“三大黄金玉米带”。数据统计表明,2009年东北玉米种植面积占全国玉米种植面积的28%,玉米产量占全国玉米总产量的30%左右(中华人民共和国国家统计局,2009)。随着东北地区玉米播种面积的逐年增加传统的轮作换茬已经被连作所代替。随着玉米连作年限的增长,东北玉米带土壤肥力退化的问题日益突出(赵兰坡等,2006)。本研究在长期定位试验的基础上,采用磷脂脂肪酸方法,深入研究了3种种植方式(玉米连作、玉米非连作和撂荒)对土壤微生物群落组成的影响,以期为东北地区农业生态系统的可持续发展及建立合理的农业种植方式提供科学依据。1材料和方法1.1玉米玉米试验地点选在吉林农业大学长期定位试验田(43°48′N,125°23′E),海拔为210.7m,年平均气温为4.8℃,年平均降水量为615mm。土壤类型为草甸黑土。1984年在试验地进行匀地播种,1985–1994年为玉米(Zeamays)和大豆(Glycinemax)等作物轮作,1994年至今连种玉米。本研究选取不同种植方式如下:玉米连作不施肥(连作)、玉米非连作(当季作物为豆科,非连作)和撂荒(作为对照),重复3次。其土壤基本理化性质见表1。1.2土样的采集混合土样2009年8月3日用土钻在每个小区采集10钻表层土壤(0–20cm),混合为1个土样。样品除去动植物残体等杂质,用四分法(鲁如坤,2000)去除多余的土样,装入密封袋,立即置于冰盒中运回实验室,过2mm筛,放于4℃冰箱中保存,并尽快进行微生物群落特征分析。1.3土壤ph、磷、有机质测定土壤总碳和总氮测定采用元素分析仪(VarioELIII,ElementarAnalysensystemeGmbH,Hanau,Germany)。土壤pH测定的水土比为2.5:1。土壤有效磷测定采用Olsen法(Olsenetal.,1954)。土壤有机质测定采用水合热重铬酸钾氧化-比色法;土壤碱解氮测定采用碱解扩散法;土壤硝态氮测定采用紫外分光比色法;铵态氮测定采用靛蓝比色法(鲁如坤,2000)。土壤>0.25mm水稳性团聚体含量测定采用湿筛法(GB7846-87)。1.4脂肪酸的识别与定量参照土壤微生物群落结构的测定采用磷脂脂肪酸法。土壤微生物磷脂脂肪酸提取参照修正的Bligh-Dyer方法(Bligh&Dyer,1959),正十九烷脂肪酸甲酯(nonadecanoicacidmethylester)为内标,用气相色谱-质谱联用仪(6890GC-5973MSAgilent,AgilentTechnologies,SantaClara,USA)测定,检测中使用的升温程序如下:进样后在50℃保持1min,之后以12℃·min–1的速率升到180℃,保持2min后,以6℃·min–1的速率上升到220℃,停留2min后以15℃·min–1的速率上升到240℃,保持1min后以15℃·min–1的速率达到最终温度260℃,保持15min。气相色谱与质谱之间温度为280℃,用高纯氦气(1mL·min–1)做载气。质谱仪采用电子电离(EI)方式,电子能量为70eV。各脂肪酸的识别与定量参照细菌脂肪酸甲酯混标(BacterialAcidMethylEsters)和37种脂肪酸甲酯混标(Supelcoe37ComponentFAMEMix)。磷脂脂肪酸分子式格式一般为(i/a)X:YωZ(c/t),其中X代表碳原子的数目,Y代表分子中双键的数目,Z指第一个双键距磷脂脂肪酸分子甲基(ω)的位置。前缀“i”或“a”代表距第二、第三碳原子上的支链,后缀“c”或“t”指分子的顺反结构。“cy”代表分子中具有环丙基结构。磷脂脂肪酸18:2ω6,9指示真菌群落生物量;磷脂脂肪酸14:0、15:0、i15:0、a15:0、16:0、i17:0、a17:0、17:0、cy17:0、16:1ω7t、i19:0、cy19:0指示细菌脂肪酸(Frostegård&Bååth,1996;Zelles,1999);同时用饱和脂肪酸(normalsaturatedfattyacids,NSAT)14:0、15:0、16:0、17:0、18:0之和辅助指示细菌生物量;革兰氏阳性菌用支链脂肪酸(terminallybranchedsaturatedfattyacids,TBSAT)i15:0、a15:0、i16:0、i17:0表示;革兰氏阴性菌用单烯不饱和脂肪酸(monounsaturatedfattyacids,MONO)16:1ω7t、18:1ω8c、18:1ω9c或环化脂肪酸(cyclopropylfattyacids,CYCLO)cy17:0、cy19:0表示;微生物群落总量以各磷脂脂肪酸加和表示(Zellesetal.,1992;Böehmeetal.,2005)。1.5微生物群落结构分析应用SPSS16.0处理数据,采用单因素方差分析检验不同处理之间的差异,同时应用此软件对微生物群落结构做主成分分析(principlecomponentanalysis,PCA)。应用CANOCO4.5进行冗余分析(redundancyanalysis,RDA)。作图在SigmaPlot10.0软件中进行。2环境因子对土壤微生物群落结构的影响在不同的种植方式下,总磷脂脂肪酸、细菌磷脂脂肪酸、真菌磷脂脂肪酸和真菌/细菌发生变化。其中,总磷脂脂肪酸和细菌磷脂脂肪酸变化趋势相似(表2):撂荒土壤总磷脂脂肪酸和细菌磷脂脂肪酸分别为42.98和24.68nmol·g–1,分别高于连作和非连作;连作土壤微生物总磷脂脂肪酸和细菌磷脂脂肪酸最低,分别为33.12和18.09nmol·g–1。非连作土壤真菌磷脂脂肪酸和真菌/细菌分别为0.61nmol·g–1和3.06%,显著低于撂荒和连作(p<0.05)。饱和脂肪酸(NSAT)可代表总细菌生物量;支链脂肪酸(TBSAT)在革兰氏阳性细菌中所占比例较高,可指示革兰氏阳性细菌的生物量;单烯不饱和脂肪酸(MONO)和环化脂肪酸(CYCLO)常见于革兰氏阴性细菌;TBSAT/MONO和TBSAT/CYCLO比值可指示革兰氏阳性细菌/革兰氏阴性细菌,MONO/NSAT可以指示土壤环境条件的变化。如图1所示,撂荒处理的细菌群落的指标都达到最大,连作处理的细菌生物量指标的NSAT和指示革兰氏阳性细菌的TBSAT含量最低,非连作处理的指示革兰氏阴性细菌的MONO和CYCLO含量最低。TBSAT/MONO和TBSAT/CYCLO变化规律相似:非连作>连作>撂荒。MONO/NSAT在撂荒处理中最高,而在非连作处理中最低。主成分分析是处理数学降维的一种方法,将多个变量通过线性变换以选出较少个数重要变量。主成分个数的提取原则是主成分对应的特征值大于1的前m个主成分。根据此原则,共提取出了6个主成分,累计贡献率达98.25%。其中,第一主成分(PC1)贡献率是31.16%,第二主成分(PC2)贡献率是22.80%。第三至第六主成分贡献率分别是16.48%、13.08%、10.21%、5.65%,因贡献率太小,所以本文只解释第一主成分和第二主成分(图2A)。对26种磷脂脂肪酸进行主成分分析发现,不同种植方式土壤微生物群落结构在第一主成分上出现明显的分布差异:连作和非连作土壤微生物群落结构相似,分布于第一主成分负方向上,而撂荒分布于第一主成分正方向上。进一步对主成分得分系数进行方差分析发现,撂荒处理的第一主成分得分系数与连作和非连作差异显著(p<0.05),而各处理的第二主成分得分系数差异不显著(表3)。单个磷脂脂肪酸初始载荷因子主成分分析结果表明,对第一主成分起主要作用的磷脂脂肪酸是15:0、16:1ω7t、cy17:0、18:2ω6,9;对第二主成分起主要作用的磷脂脂肪酸是cy19:0、18:1ω7t、10Me19:0、10Me18:0(图2B)。主成分分析揭示了不同处理土壤微生物群落结构的区别,冗余分析(redundancyanalysis,RDA)则可进一步确定样地中环境因子对土壤微生物群落结构的影响(McKinleyetal.,2005)。选取有机质(SOM)、总碳(TC)、总氮(TN)、硝态氮(NO3–-N)、铵态氮(NH4+-N)、碱解氮(AN)、有效磷(AP)、pH和土壤>0.25mm水稳性团聚体含量(SWSA)作为环境因子。箭头越长表示该环境因子对微生物群落结构的影响越大;箭头所成的夹角越小表示相关性越大。由图3可以看出,pH、TN、有效磷和土壤>0.25mm水稳性团聚体的含量与大部分磷脂脂肪酸箭头指向一致,说明它们之间呈正相关。根据箭头的长度得出,pH和土壤>0.25mm水稳性团聚体对土壤微生物群落的影响最大。3对土壤微生物的影响目前磷脂脂肪酸分析方法被广泛地应用于土壤微生物群落结构多样性的研究。磷脂脂肪酸存在于活体微生物的细胞膜上,作为生物标记物可以揭示微生物的种群,具有较高的准确性和敏感性(Kauretal.,2005)。大量的研究表明,土壤耕作和植物种类等是影响土壤微生物群落结构的主要因素(Nusslein&Tiedje,1999;Calderónetal.,2000)。不同种植方式对土壤微生物产生较大影响,土壤微生物群落变化明显(Cooksonaetal.,2008)。耕作土壤的总磷脂脂肪酸和细菌磷脂脂肪酸小于撂荒处理,较少的农业措施干预,可以保持土壤微生物群落结构的丰富度和均匀度,而长期高强度的农业耕作措施可能会抑制黑土细菌群落的生长(白震等,2008)。土壤团聚体是微生物生存的重要场所,现已发现大团聚体中的微生物生物量比微团聚体中的高(Franzluebbers&Arshad,1997),耕作改变了土壤团聚体的特征,长期的传统耕作破坏了表层土壤团聚体,耕作后土壤团聚体的数量和直径小于未耕作的土壤(Bünemannetal.,2004),而休闲耕作可以显著地增加土壤团聚体的数量和大小(Franzluebbers&Arshad,1996)。本研究中,撂荒增加了土壤>0.25mm水稳性团聚体的含量,改善了土壤结构,有利于微生物生长。不同种植方式改变了覆盖土壤的植物种类,植物通过影响土壤环境,进而影响土壤微生物的群落结构(Nusslein&Tiedje,1999)。非连作种植豆科作物有利于固氮菌等细菌群落的生长,土壤真菌/细菌下降。个别磷脂脂肪酸载荷因子的结果表明,真菌和部分细菌受种植方式影响明显。TBSAT被认为是革兰氏阳性细菌的重要生物标记物,MONO和CYCLO是革兰氏阴性细菌的有效标识物(Frostegård,etal.,1993)。TBSAT/MONO和TBSAT/CYCLO的变化规律相似,都可表示革兰氏阳性细菌/革兰氏阴性细菌。撂荒处理的革兰氏阳性细菌/革兰氏阴性细菌低于连作和非连作处理研究表明节杆菌(Arthrobacter)等革兰氏阳性细菌对环境胁迫如饥饿的适应能力强于假单胞菌(Pseudomonas)等革兰氏阴性细菌(Kieftetal.,1994),撂荒改善土壤条件,有利于革兰氏阴性细菌的积累。MONO/NSAT可评估微生物群落与环境条件。Böhme等(2005)研究德国两个长期施肥试验点砂壤土和壤土土壤微生物特征的变化,试验土壤轮作甜菜(Betavulgaris)、春大麦(Hordeumvulgare)、土豆(Solanumtuberosum)和冬小麦(Triticumaestivum),3月份采样,研究表明农田土壤施肥及对照MONONSAT的比值一般大于1,而本研究中各处理的MONO/NSAT小于1,可能与土壤类型、采样时间及种植作物类型等因素有关。冗余分析(RDA)可以合理地解释环境因子对土壤微生物群落结构的影响(Kennedyetal.,2004)。本研究得出,pH、TN、有效磷、土壤>0.25mm水稳性团聚体含量与大部分磷脂脂肪酸之间呈正相关关系。土壤pH、TN、有效磷是影响土壤微生物群落结构的重要环境因素,因为土壤微生物的生长状况取决于土壤肥力和营养元素供给(Zelles,1999)。磷脂脂肪酸法是目前测定微生物群落结构的常用方法。该方法可直接检测微生物群落,避免培养和计数方法引起的问题,实验条件要求低,相对容易快速处理大量样品,可以全面精确地反映土壤微生物的群落信息。当然,磷脂脂肪酸方法也存在一些问题:磷脂脂肪酸方法不能在种属和株系水平鉴定微生物的种类;尚未确立土壤中所有微生物特征脂肪酸;不能鉴定古菌。因此,可以结合其他研究微生物多样性的方法更加全面地认识土壤微生物群落结构。本研究中得到的磷脂脂肪酸的结果与采用Biolog方法测定的结果一致(时鹏等,2010