caco-2细胞模型的建立及药物吸收研究的初步应用

caco-2细胞模型的建立及药物吸收研究的初步应用

口服给药是一种传统的给药方法，相对安全、方便，容易被患者接受。目前口服药物制剂的开发已成为药学界的研究重点。用于药物吸收的试验方法包括体内和体外两部分。体外试验能提供较直观的药物吸收过程的证据,因此被广泛采用。近十几年来,国外已普遍采用组织细胞模型作为药物筛选的工具,其中包括Caco-2细胞(thehumancolonadenocarc-inomacelllines)单层模型。Caco-2细胞系来源于人类结肠癌及直肠癌,普通培养条件下即可在有孔的多聚碳酸酯膜上自发的分化为肠上皮细胞单层,因此可以模拟体内小肠上皮细胞层,然而体外试验得到的数据必定与体内试验有差异。为缩小这种差异,使体外与体内的数据有更好的相关性,预测药物在体内的吸收过程,为临床筛选药物提供依据,我们于2003~2004年建立了Caco-2细胞模型,并对该模型的单层完整性、通透性以及P-糖蛋白(P-gp)的表达进行了验证。现将结果报告如下。1材料和方法1.1荧光黄、普奈洛尔、乙腈标准品DMEM培养基(GIBCO);胎牛血清(杭州四季青);非必需氨基酸(NEAA,GIBCO);胰蛋白酶(上海生工);荧光黄、普奈洛尔以及维拉帕米标准品(均购自Sigma);乙腈(色谱纯,Dikma);其余试剂均为分析纯。Waters高效液相色谱系统:Waters515泵、Waters717plus自动进样器、Waters2487紫外检测器、WatersMillennium32色谱数据处理软件。1.2dmem培养基Caco-2细胞来源于美国细胞、菌种库(ATCC)。在37℃,含5%CO2的环境中培养。DMEM培养基含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸以及100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素双抗液。细胞接种在12孔Transwell板上,接种密度为2×105/孔,第1周隔天换液,后2周每天换液,生长至21d左右细胞形成紧密的单层。装置图参见文献。1.3胞单层顶生型检测①单向转运试验:将荧光黄和普奈洛尔分别加于Caco-2细胞单层顶端(A面),分别于3h及1h后从基底端(B面)取样进行检测。②双向转运试验:将维拉帕米分别加于Caco-2细胞单层的A面或B面,2h后从B面或A面取样进行检测。1.4细胞模型的验证试验1.4.1细胞电泳的测定在每种药物的转运试验进行前及结束后,均用细胞电位仪(EVOM)测定在pH为7.2~7.4时的跨上皮细胞电阻(TEER),确定单层细胞的紧密性与完整性。1.4.2caco-2细胞单层端基底端转运试验荧光黄和普奈洛尔分别用作Caco-2细胞单层模型的细胞旁转运及跨细胞被动转运的标记物;将其跨膜通透率作为检测细胞单层紧密性与通透性的标准。在pH为7.2~7.4的情况下,进行荧光黄和普奈洛尔从Caco-2细胞单层顶端(A面)→基底端(B面)的转运试验。试验前,细胞用HBSS(pH7.4)液小心冲洗3次,最后一次在37℃培养箱中孵育0.5h后轻轻吸干孔内HBSS,以清除细胞表面对测定有干扰的物质。根据试验设计,在A面分别加浓度为荧光黄330μg/ml及普奈洛尔100μmol/L;B面加HBSS。放入37℃孵育,分别于给药后3h和1h收集B面的溶液,测定其中的药物浓度,计算通透率,并与文献报道值比较。1.4.3测定药物的透明率先将维拉帕米(经典的P-gp底物)作为底物,验证P-gp对其外排作用;然后加入酮康唑(P-gp的强抑制剂),检验酮康唑对维拉帕米外排的抑制作用。在未加或加入酮康唑的条件下,同时进行维拉帕米转运试验(A面→B面和B面→A面),测定药物浓度,分别计算通透率。转运试验方法同1.4.2所述。1.5测试指标1.5.1黄光裕浓度采用荧光分光光度计法(F-3010荧光分光光度计,美国),激发波长为427nm,发射波长为536nm。1.5.2不锈钢柱、流动相、相采用高效液相色谱法(HPLC)。色谱柱为HypersilBDSC18(I.D.4.6mm×150mm,5μm)不锈钢柱(大连依利特公司生产);流动相为25mM磷酸二氢钾缓冲液∶乙腈(60∶40),用磷酸调pH至2.5;流速1.0ml/min;检测波长290nm;进样量20μl;采用维拉帕米150μg/ml作为内标。1.5.3缓冲溶液ph采用HPLC法。色谱柱同前;流动相为50mM磷酸二氢钾缓冲液∶乙腈(60∶40),用磷酸调pH至3.6;流速1.0ml/min;检测波长278nm;进样量20μl;采用普奈洛尔13.2μg/ml作为内标。1.6ac0根据下式计算:Papp=[(dC/dt(V)]/(A×C0)。C0为加药侧的药物初始浓度,dC/dt为在接受侧药物出现的速率,V为接受侧的溶液体积,A为Transwell多聚碳酸酯膜的表面积。2结果2.1溶液中的药物浓度2.1.1标准曲线方程aHBSS溶液中荧光黄的标准曲线方程为:A=34.176C+12.947,r=0.9990(n=5)。线性范围为0.50~10.0μg/ml。其中C为荧光黄的浓度(μg/ml),A为荧光黄的吸光度值。普奈洛尔的标准曲线方程为:Y=0.0664C-0.141,r=0.9989(n=8)。线性范围为1~200μmol/L。其中,C为普奈洛尔的浓度(μmol/L),Y为普奈洛尔在HPLC图上的峰面积与内标物峰面积的比值。维拉帕米的标准曲线方程为:Y=0.273C-0.6562,r=0.9997(n=8)。线性范围为0.5~200μmol/L。其中,C为维拉帕米的浓度(μmol/L),Y为维拉帕米在HPLC图上的峰面积与内标物峰面积的比值。2.1.2回收率、精密度与定量限配制普奈洛尔低浓度(2.5μmol/L)、中浓度(10μmol/L)、高浓度(100μmol/L)浓度的HBSS溶液,分别进样,测峰面积比值,按2.1.1项下标准曲线求得药物浓度,并与实际浓度相比较,求得方法回收率98.03%~102.46%。每样本测定5次,连续测定3d,高、中、低浓度的日内、日间精密度均小于5%。证明该方法适用于普奈洛尔含量的测定。同样,配制维拉帕米的低浓度(2.5μmol/L)、中浓度(10μmol/L)、高浓度(100μmol/L)的HBSS溶液进样检测,求得该方法回收率为90.33%~103.58%,日内、日间精密度均<5%。证明该方法适用于维拉帕米含量的测定。2.1.3稳定性研究设计普奈洛尔及维拉帕米在HBSS溶液(pH=7.2~7.4)中的稳定性研究表明,低、中、高浓度药物在37℃中2h、室温6h以及进样器中8h含量无明显变化,RSD<5%,证明这两种药物在试验条件下稳定性良好。2.2细胞模型验证的结果2.2.1细胞单层厚度转运试验开始前及结束后,通过EVOM测得的细胞单层TEER值均大于250Ω/cm2,说明Caco-2细胞单层在pH值为7.2~7.4时是完整的。2.2.2细胞旁转运及跨细胞被动运转曲线细胞旁及跨膜转运标记物的表观渗透分数见表1。如表1所示,细胞旁转运及跨细胞被动转运的标记物荧光黄和普奈洛尔的Papp值均与文献报道的参考值一致,提示Caco-2细胞模型的细胞旁及跨细胞转运通路在pH为7.2~7.4时未受到影响。2.2.3p-gp对装置的外排作用10μmol/L的酮康唑通常被认为能有效的抑制Caco-2细胞模型中P-gp对维拉帕米的外排作用。本试验中,维拉帕米的外排能被酮康唑有效抑制(P<0.05)。证实在Caco-2细胞单层模型中P-gp能有效表达。3caco-2细胞模型Caco-2细胞作为药物吸收研究的一种快速筛选工具,能够在细胞及分子水平提供关于药物分子通过小肠黏膜的吸收、代谢、转运的信息;细胞分化的极性有助于研究药物双方向(肠腔侧→肠壁侧或肠壁侧→肠腔侧)的转运率,从而对主动转运的药物进行研究;各种转运系统及代谢酶在Caco-2细胞的表达,使该模型的研究结果与体内药物的处置有较好的相关性;Caco-2细胞来源于人体,不会造成各种药动学性质的种属差异,其结果有较好的重现性;Caco-2细胞模型的试验条件,如转运介质的pH值及药物浓度比较容易控制。Caco-2细胞的培养及模型建立的方法已有较多文献报道。但曾有研究显示,由于细胞来源的不同及细胞分化过程中的异质性造成不同实验室在细胞形态、单层完整性以及转运特性方面有差异。本实验室采用ATCC来源的细胞,在细胞单层长至培养瓶底面积的60%~80%时[(7~10)×10-6个细胞)]进行传代,而单层超过80%培养瓶底面积的细胞弃置不用,以此避免细胞分化过程中的异质性。在传代过程中,为避免Caco-2细胞过度成团的特性以及由此造成的计数不准确,我们采用低浓度的胰蛋白酶-EDTA(0.05%∶0.02%)进行消化。Caco-2细胞接种于微孔滤膜上可形成单层吸收模型,该滤膜可由硝酸纤维素或者多聚碳酸酯制成。由于硝酸纤维素膜可以和脂溶性化合物结合,从而形成药物扩散过程中的屏障,因此我们选用无此种作用的多聚碳酸酯膜作为细胞单层模型的支架。在对细胞模型通透性的验证试验中,跨细胞被动转运标记物普奈洛尔的Papp值与文献报道的接近,说明该模型的通透性较好,可用于被动转运化合物吸收机制的研究;而细胞旁转运标记物荧光黄的Papp值在文献报道的范围内,证明该模型的完整性良好,细胞旁紧密连接是完整的,可用于细胞旁转运化合物的转运研究,对非细胞旁转运的化合物不会造成影响。在对细胞模型P-gp表达的验证试验中,作为P-gp的标准底物,维拉帕米在双向转运试验中表现出明显的外排特性,A面→B面的Papp值远小于B面→A面的Papp值(P<0.05),说明P-gp在该细胞模型中的有效表达;而加入P-gp的强抑制剂酮康唑后,维拉帕米在细胞单层A面的外排被明显的抑制,进一步显示了该模型中P-gp的表达,且P-gp存在于细胞模型的A面,即肠腔面,与体内一致。证明Caco-2细胞模型用于经P-gp作用的化合物研究中结果是可靠的。文献报道的TEER值为150~500Ω/cm2,主要是培养条件不同造成的。TEER值由离子经细胞旁间隙的流动形成,由于离子的大小及所带电荷的不同,导致TEER值变化较大;而离子本身经细胞旁间隙透过的总量是不变的。提示用细胞旁转运的标记物(如荧光黄、甘露醇等)进行细胞旁间隙的大小及紧密连接的监测,比TEER的敏感性更高;由于不同实验室培养条件不同,使得TEER值不具可比性。有研究报道,Caco-2细胞模型对由载体介导的主动转运的化合物的通透