小鼠睾丸组织发育过程中精原细胞的形成

小鼠睾丸组织发育过程中精原细胞的形成

睾丸是一个重要的雄性生殖腺，能产生男性和雄性激素，对雄性生殖系统的发育起着重要作用。因此,对其组织学水平的连续、系统研究可全面反映其结构与功能变化的规律。小鼠精子发生过程其步骤已然清楚,但每一步骤与小鼠日龄的具体对应关系,系统性的实验并不多见。为此,我们系统观察了处于不同发育时期昆明种小鼠的睾丸组织,期望较为完整揭示小鼠睾丸发育过程中结构的变化规律,探讨其与功能活动的相互关系,为后续基因及蛋白质水平的研究打下良好基础。从而为男性生育的临床研究提供理论及动物实验的依据。1材料和方法1.1生物材料1.1.1生后生龄实验选用昆明种健康雄鼠,购自昆明医学院实验动物中心。小鼠分组为:生后1日龄、4日龄、8日龄、11日龄、15日龄、20日龄、23日龄、27日龄、30日龄、33日龄、36日龄、40日龄、43日龄、47日龄、50日龄、54日龄和57日龄。每组取5只小鼠。1.2实验方法1.2.1甲醛固定,酒精包装小鼠断颈处死后取睾丸,10%中性甲醛固定,酒精系列脱水,二甲苯透明,常规石蜡包埋。切片厚5μm,贴于载玻片上,室温干燥备用。1.2.2树胶的制备切片于37℃的二甲苯中脱蜡10min,然后在室温下保温5min。系列酒精逐级复水后,苏木精染液染色6min,自来水冲洗,1%盐酸酒精溶液分色数秒,自来水冲洗,入淡氨水中3min蓝化胞核,自来水冲洗,0.5%伊红染液中染色5min,自来水冲洗,乙醇系列逐级脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。Olympus显微镜下观察照相。2h.e染色结果显示2.11原始生精细胞核曲细精管呈空心管状,由支持细胞和原始生精细胞构成。原始生精细胞核呈圆形或椭圆形,基本排列成一层,紧贴基膜;支持细胞的核为三角形或不规则形,体积较原始生精细胞略小。2.24年龄见图1-2曲细精管直径较1日龄增大,部分曲细精管的细胞层数已从1层增加至2层,从形态上观察,细胞类型仍然只有支持细胞和原始生精细胞两种。2.38细胞细胞间质中表达增加部分曲细精管内细胞层数增为3～4层,细胞移向管腔中央。靠近基底膜的1～2层生精细胞细胞核较大,染色浅。而靠近管腔的细胞胞核致密,染色较深。这意味着这一时期原始生精细胞已分化成A、B两种精原细胞。2.41细胞松茸、感染后细胞间质的变化曲细精管直径继续增大,部分曲细精管管内空腔化重新出现,而其余曲细精管仍维持8日龄时状况,被细胞疏松填满。曲细精管内细胞多由3～4层组成,其中,细胞核致密、染色深的B型精原细胞较8日龄睾丸明显增多。2.51生长精原细胞生精上皮细胞层数继续增多,细胞进一步分化。B型精原细胞移向基膜,活跃地进行增殖。有的曲精管中可清楚看到处于有丝分裂各时相的精原细胞。同时,这一时期部分曲细精管在靠近管腔处开始出现初级精母细胞,细胞体积较精原细胞明显增大,细胞核较为疏松,染色浅。2.62曲细精管的空腔化随曲细精管直径的进一步增大,管腔空腔化更为明显,所有曲细精管中均出现初级精母细胞,且初级精母细胞所占比例增大,而精原细胞所占比例减小。2.72基底膜抑制因子曲细精管直径较20日龄睾丸明显增大,生精上皮细胞层数显著增多,细胞出现更多分化。从形态学指征判断:紧靠基底膜的1层细胞为精原细胞,细胞较小,细胞核染色深,第2层细胞为初级精母细胞,细胞核较大,染色较浅,在初级精母细胞以内,第3~4层细胞为次级精母细胞,细胞核较初级精母细胞明显变小。有的曲细精管甚至有体积更小,细胞核为圆形的精子细胞少量出现在靠管腔处。2.82次级精母细胞观察曲细精管直径继续增大,管内空腔化更为明显,大量圆形精子细胞出现,而次级精母细胞由于存在时期短,观察到的几率减少。这一时期可在一个曲细精管平面上看到精原细胞,初级精母细胞、次级精母细胞及圆形精子细胞。2.93小鼠精子的长丝曲细精管管腔截面积进一步增大,细胞层数更为增多,很多曲细精管内靠近管腔的细胞胞核开始出现细长梭状,这意味着圆形精子已开始变形、伸长,出现长形精子细胞及正在变态的精子,大多数精子头部扎于支持细胞内。同时,管腔内亦观察到少量精子的出现。2.1033天的睾丸见图1-10曲细精管直径及生精细胞组成类型与30日龄睾丸相比变化不大。但绝大多数管腔内反而没有观察到精子的出现。2.11曲细精管正中细胞的结构曲细精管直径较33龄睾丸明显增大,大量精子重新出现于每个曲细精管的管腔中。这意味着生精上皮细胞已有了完全分化。曲细精管截面上可见精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞及成熟精子等各级细胞。在绝大多数曲细精管正(中)横截面上,精原细胞贴近基膜,排列成一层,这一层细胞体积小,排列紧密,细胞核小而致密(染色深),核为圆形或椭圆形。第二层细胞为体积与核都较大的初级精母细胞。初级精母细胞以内为胞体和胞核均明显小得多的次级精母细胞和更小的圆形精子细胞,这一时期曲细精管中已有大量充分变态或正在变态中的精子。2.1240天的睾丸见图1-12这一时期睾丸无论在曲细精管的直径还是在管内细胞的类型上都与36日龄睾丸较为相似。2.1343、47、50、54和57日的睾丸这五个时期的睾丸在曲细精管的直径还是在管内细胞的类型上均与40日龄睾丸基本没有区别。3小鼠精子的分离纯化哺乳动物的精子发生是一个复杂的细胞分化过程,其依赖于一个真正的干细胞群体,它们具有自我更新和产生后代分化为精子的能力。生精细胞起源于原始生殖细胞,在生精索时其形态学就发生了改变,演变成为生精母细胞,并停留在G0/G1期直到出生,而后发育成A型精原细胞。经过分裂,A型精原细胞的一些后代分化为居间精原细胞,它们再发育成B型精原细胞。数次有丝分裂后,B型精原细胞逐渐增大,并离开基膜向曲精管管腔运动,转变为初级精母细胞。初级精母细胞通过第一次减数分裂产生两个次级精母细胞,次级精母细胞的间期很短,不发生DNA复制就进入第二次减数分裂,生成单倍体的圆形精子细胞。圆形精子细胞通过一系列复杂的形态变化,发育为具有头、颈、尾结构的精子。精子发生按其顺序,大致包括三个阶段:第一阶段从是精原干细胞经有丝分裂、分化发育形成初级精母细胞;第二阶段是初级精母细胞经减数分裂I形成次级精母细胞,再经减数分裂II形成单倍体精子细胞;第三阶段是精子细胞变态,包括顶体发生、核浓缩拉长、尾形成,多余胞质脱落,形成高度分化的精子。本研究中,昆明种正常小鼠生后1d时睾丸曲细精管中只有支持细胞和原始生精细胞,后者进一步增殖分裂;8d时曲细精管中出现B型精原细胞,其比例经不断有丝分裂过程后逐步增大;15d时生精上皮有了明显分化,初级精母细胞出现,精子发生完成第一阶段。至生后23d时,曲细精管中出现次级精母细胞及少量圆形精子细胞,此后圆形精子细胞逐渐增多;27d时观察到大量圆形精子细胞出现,说明精子发生已完成第二阶段。30d时观察到圆形精子细胞出现细胞核的变形、伸长,且在管腔中开始有精子的出现;而生后33d时反而在管腔内基本没有观察到精子;至36d时又发现大量精子重新出现于曲细精管管腔中,此后各期管腔中精子均稳定出现,这意味着小鼠生精上皮真正成熟的时期是生后36d,而不是精子首先出现的30d。以上研究结果表明:小鼠生精细胞的发育从出生后就开始,经过一个相对连续的发育分化过程后,至生后约36d发育成熟。本研究中部分结果与于洁等关于正常昆明小鼠精子发生的组织学观察有所不同,如初级精母细胞及圆形精子细胞的出现均明显较晚。这可能是由于国内各地昆明小鼠遗传背景不很一致,导致不同地饲养的昆明小鼠封闭群在生长发育与繁殖性