Chemotherapeutic leukopenia标志物的初步分析及中药复方预防方案的Meta分析

题目：Chemotherapeuticleukopenia标志物初步分析及中药复方预防方案的Meta分析目录摘要 前言结直肠癌是消化道常见的恶性肿瘤之一，发病率逐年提升。目前临床常见治疗结直肠癌方法包括外科手术治疗、辅助化疗、新辅助化疗、精准治疗等ADDINNE.Ref.{B494090B-CEDD-4DD5-81A5-4CC935A0D0ED}[1]。其中化疗是最常见的治疗手段，5-氟尿嘧啶类化疗药物是治疗结直肠癌的一线化疗用药。卡培他滨在体内经过三步代谢机制转化为有活性的5-氟尿嘧啶，与其它化疗药物相比，具有口服用药方便、疗效好、不良反应轻的特点ADDINNE.Ref.{6701AD1B-6127-47C9-8D4C-E4B4AA5F2F68}[2]。5-氟尿嘧啶经过进一步体内代谢生成5-氟尿嘧啶脱氧核苷酸和5-氟尿嘧啶核苷进而发挥抗肿瘤作用。但是这些代谢产物可以通过伪代谢物的形式掺入到正常细胞DNA和RNA中，产生细胞毒性，从而导致不良反应的发生ADDINNE.Ref.{74A36BC8-98FA-46F4-B42B-D9CD51D6805D}[3]。骨髓抑制是使用5-氟尿嘧啶类化疗方案可能引起的常见不良反应之一，表现为贫血、血小板或白细胞的数量减少。据相关文献报道，其化疗性骨髓抑制的发生率高达70%至90%ADDINNE.Ref.{E2A2C827-DBDB-4513-8556-8F8FCB065046}[4]。根据课题组前期（2016年5月到2017年12月）在长征医院开展的观察性临床试验结果，在接受卡培他滨方案化疗的127例结直肠癌患者当中，中性粒细胞减少症的发生率为80.31%。其中，严重（大于二级）中性粒细胞减少症发生率为的3.15%ADDINNE.Ref.{A6536EC1-EC49-48AE-868D-9823018210B2}[5]。化疗药物可以直接杀伤外周血白细胞，干扰或抑制正常粒细胞核酸的生物合成，进而影响粒细胞的代谢，阻碍粒细胞的分裂；化疗药物同时可以损伤骨髓造血干细胞，从而导致骨髓生成白细胞的能力下降ADDINNE.Ref.{16A13EA3-4585-48EC-BBA0-B1CEC6A1E9A0}[6]。白细胞减少典型表现为头晕、肢体酸软、乏力、食欲减退、精神萎靡、低热等ADDINNE.Ref.{3246D785-10AB-4FDB-B124-5FB00E03D47B}[7]。由于基因、饮食习惯、环境的差异，不同患者对化疗药物的敏感性、耐受性都存在潜在差异。目前现有文献中使用基因检测和代谢组学的方法研究基因或内源性代谢物和化疗不良反应之间的关系，用于预测结直肠癌患者接受化疗后是否会出现不良反应。其中代谢组学是研究生物体系在受到外界刺激或者基因修饰时所引起其机体代谢物变化的一门学科ADDINNE.Ref.{0EAF42B9-E771-494D-BC1C-F356B9D075EA}[8]。代谢组学可以通过研究不良反应发生和未发生患者间内源性代谢物之间的差异离子或化合物，寻找代谢物和生理病理变化之间的潜在关系，进而筛选可以预测化疗不良反应的内源性标志物。目前临床上治疗白细胞减少症的西药包括重组人粒细胞集落刺激因子、咖啡酸ADDINNE.Ref.{946569E6-C8CE-47F5-8667-C6428CADC6C5}[9]、VitaminB4、利血生、多抗甲素、鲨肝醇、碳酸锂等。其在临床使用中存在价格昂贵、不良反应较多、治疗效果不稳定等问题ADDINNE.Ref.{5145FB8D-786D-4E5E-BB81-71ECC5644C93}[10]。与西药相比，中药治疗白细胞减少症作用平稳、价格低廉、能提高机体免疫功能，可以较好地改善其临床症状ADDINNE.Ref.{47987226-BBBF-4009-8E76-D879AE01001E}[7]。虽然目前临床上使用中药预防化疗所致白细胞减少症获得了可喜的进展ADDINNE.Ref.{951C7947-216C-4821-9709-143A9FF8FB8A}[11]，但是现在临床上使用的中药种类繁多，尚无综述对不同中药的疗效进行比较。本研究旨在通过对患者术前血液和组织样本进行代谢组学研究，运用软件分析化疗性白细胞减少症发生和未发生患者间内源性代谢物的差异，筛选可能预测结直肠癌化疗性白细胞减少症的内源性标志物；运用荟萃分析方法对已发表的文献进行系统全面的检索，严格评价文献质量，对文献干预实验结果进行统计分析，比较不同中药的临床疗效，制定出最佳的中药预防氟尿嘧啶类化疗药物所致白细胞减少的用药方案。第一部分Chemotherapeuticleukopenia标志物的初步分析1材料1.1样本来源组织样本和血液样本均来自课题组前期在上海市长征医院收集的样本。1.2主要仪器设备与试剂表1-1主要仪器设备Table1-1maininstrumentsandequipment仪器设备型号厂商UHPLC系统1290系列Agilent，美国四元泵G1311AAgilent，美国真空脱气机G1322AAgilent，美国自动进样器G1329AAgilent，美国柱温箱G1316AAgilent，美国三重四级杆串联质谱仪6530Q-TOF-MSAgilent，美国十万分之一电子分析天平BP1106Sartorius，德国台式冷冻离心机UNIVERSAL32RHettich，德国定时可调速漩涡混合器XW-01上海医科大学仪器厂超声仪SK7200H上海科导超声仪器有限公司HILIC-Z（2.1×150mm）色谱柱No.673775-924Agilent，美国HILIC-Z(2.1×5mm）预柱No.821725-947Agilent，美国C181.7μm2.1×100mm色谱柱No.186005297Agilent，美国C181.7μm2.1×5mm预柱No.186005303Waters，美国表1-2主要实验试剂

Table1-2mainexperimentalreagents仪器设备使用级别批号纯度厂商p-氯化苯丙氨酸标准品C0253＞98%Sigma，美国甲酸铵标准品A5597≥98.0%SIGAMALDRICH，美国异丙醇分析纯106＞99Merck，德国氯仿分析纯C0761524023＞99Merck，德国甲酸色谱纯TS0911CA1498%Tedia，德国甲醇色谱纯JB03810799.9%Merck，德国乙腈分析纯JA05910399.9%Merck，德国纯净水屈臣氏，中国2方法2.1样品前处理2.1.1血液样本对待测的血液样本进行蛋白沉淀法的预处理方法，然后精密吸取0.2mL血浆于1.5mLEP管内，然后加入0.8mL的2：1（三氯甲烷：甲醇）的混合液并充分涡旋,然后在4℃的环境下使用12000r·min-1离心10min，精密吸取上层极性液体0.3mL同时加入0.9mL的甲醇涡旋，然后置于上述12000r·min-1的环境下离心10min，取上清液即为上层极性代谢物。使用移液枪枪头尖端缓慢的穿过蛋白质圆盘精密的吸取下层有机相0.4mL，置于室温下经过氮气吹干，精密量取0.5mL的2：2：1（乙腈：异丙醇:水）混合液复溶即得下层非极性代谢物。分别对每个样本的上下层精密吸取20μL，然后分别混合均匀作为质量控制样样品（QC）。2.1.2组织样本取结直肠癌患者组织样本，室温下解冻，滤纸吸干表面血水，精密称定质量约100mg，置于5ml离心管中，以1:5（m/v）比例加入0.9%氯化钠注射液，于冰水浴下使用超细匀浆机15000r·min-1下匀浆2min制备组织匀浆液。匀浆液置于冰水浴下超声5min后，再置于离心机中4℃、19060*g下离心15min，吸取上清液于-80℃下保存。取上清液0.2mL，加入萃取剂（三氯甲烷：甲醇）0.8mL，涡旋1min，再置于离心机中4℃、12000*g下离心10min。取上层含极性代谢产物的液体，加入含内标4-氯-DL-苯丙氨酸甲酯盐酸盐0.2μg·ml-1的乙腈，涡旋2min，在4℃、12000*g下离心10min，取上清液进样；取下层非极性层0.1ml，于室温下挥干，使用乙腈：异丙醇：水=2:2:1进行复溶，涡旋2min，在4℃、12000*g下离心10min，取上清液进样。取上述制备好的极性样本，各取10μL，涡旋2min，在4℃、12000*g下离心10min，取上清液作为记性代谢产物的质控样本；同理制备非极性代谢产物的质控样本。2.2UHPLC-Q-TOF-MS检测条件2.2.1血液样本表1-3血液样品色谱检测条件Table1-3chromatographicdetectionconditionsofbloodsamples检测条件极性非极性系统安捷伦1290超高效液相色谱（UHPLC）系统安捷伦1290超高效液相色谱（UHPLC）系统色谱柱HILIC-Z2.1×150mm色谱柱+HILIC-Z2.1×5mm预柱T33.5μm2.1×100mm色谱柱+C181.7μm2.1×5mm预柱柱温40℃65℃流速0.5mL·min-10.3mL·min-1流动相A纯水（10mM甲酸铵）60%乙腈的水溶液（0.1%甲酸+10mm甲酸铵）流动相B90%乙腈（10mM甲酸铵）90%的异丙醇的水溶液（0.1%甲酸+10mm甲酸铵）进样体积10μL10μL表1-4极性分子梯度洗脱条件Table1-4polarmoleculargradientelutionconditions时间(min)A(%)B(%)00100529812138713168420307024604024.1703028703028.10100330100表1-5非极性分子梯度洗脱条件Table1-5non-polarmoleculargradientelutionconditions时间(min)A(%)B(%)09010490105653512.540601919919.58515298515表1-6质谱检测条件Table1-6massspectrometrydetectionconditions检测条件极性非极性系统安捷伦6530四级杆-飞行时间质谱（Q-TOF-MS）系统安捷伦6530四级杆-飞行时间质谱（Q-TOF-MS）系统采集模式全信息串联质谱（MSE）离子模式正离子/负离子正离子毛细管电压4000V4000V截取锥电压65V65V气体温度350℃350℃气体流速11L·min-111L·min-1捕获范围100~1700m/z100~1700m/z2.2.2组织样本表1-7组织样品色谱检测条件Table1-7chromatographicdetectionconditionsoftissuesamples检测条件极性非极性系统安捷伦1290超高效液相色谱（UHPLC）系统安捷伦1290超高效液相色谱（UHPLC）系统色谱柱HILIC-Z2.1×150mm色谱柱+HILIC-Z2.1×5mm预柱HILIC-Z2.1×150mm色谱柱+HILIC-Z2.1×5mm预柱柱温40℃65℃流速500μL·min-1300μL·min-1流动相A纯水（10mM甲酸铵）60%乙腈的水溶液（0.1%甲酸+10mM甲酸铵）流动相B90%乙腈（10mM甲酸铵）异丙醇：水=9：1（0.1%甲酸+10mM甲酸铵）进样体积10μL5μL表1-8极性分子梯度洗脱条件Table1-8polarmoleculargradientelutionconditions时间(min)A(%)B(%)00100529812138713168420307024604024.1703028703028.10100330100表1-9非极性分子梯度洗脱条件Table1-9non-polarmoleculargradientelutionconditions时间(min)A(%)B(%)09010490105653512.540601919919.58515298515表1-10质谱检测条件Table1-10massspectrometrydetectionconditions检测条件极性非极性系统安捷伦6530四级杆-飞行时间质谱（Q-TOF-MS）系统安捷伦6530四级杆-飞行时间质谱（Q-TOF-MS）系统采集模式全信息串联质谱（MSE）全信息串联质谱（MSE）离子模式正离子/负离子正离子/负离子毛细管电压4000V4000V截取锥电压60V60V气体温度300℃350℃气体流速13L·min-111L·min-1捕获范围100~1700m/z100~1700m/z2.3数据分析方法运用安捷伦定性分析软件Profinder对原始数据进行初步提取、面积归一化处理，将结果转化为包含化合物保留时间和质合比等信息的txt文件。提取其中化疗性白细胞减少症发生和未发生患者的数据，运用MetaboAnalyst软件进行主成分分析(PCA)、偏最小二乘投影判别分析(PLSDA)，制作火山图进行载荷图筛选，通过分析对各组分离贡献较大(P<0.05,FC>1)化合物的串联质谱数据，经过HDMB数据库中LC-MS检索(IonMode:Neutral;AdductType:M;MolecularWeightTolerance±:2ppm)，进行质谱信息匹配，筛选其中内源性差异化合物。3结果3.1血液潜在极性化合物PCA得分图（见图1A）所示，化疗性白细胞减少症发生组和未发生组组间代谢物区分不明显，但仍显示两组间代谢物差异的趋势。为了进一步放大两组组间差异，采用PLSDA的方法进行处理，其PLSDA得分图（见图1B）显示，化疗性白细胞减少症发生组和未发生组可以明显的区分。运用Vocanonplot分析（见图1C）两组间离子峰的差异，筛选出P<0.05、组间差异FC>1的特征离子峰共118个。通过对比HMDB（人类代谢组数据库）进一步的筛选其中内源性的差异化合物，最后筛选出差异性极性化合物共5个（见表1-11NO.1-5）。AABC图1-1发生组和未发生组血液极性代谢物对比A.PCA图，B.PLSDA图，C.火山图Figure1-1comparisonofbloodpolaritymetabolitesbetweentheoccurrencegroupandthenon-occurrencegroup(A.PCAplot,B.PLSDAplot,c.volcanoplot)3.2血液潜在非极性化合物PCA得分图（见图1-2A）所示，化疗性白细胞减少症发生组和未发生组组间区别不明显。为了进一步放大两组组间的差异，采用PLSDA的方法进行处理，其PLSDA得分图（见图1-2B）显示，化疗性白细胞减少症发生组和未发生组可以明显的区分。运用Vocanonplot分析（见图1-2C）两组间离子峰的差异，筛选出P<0.05、组间差异FC>1的特征离子峰共41个。通过对比HMDB（人类代谢组数据库）进一步的筛选其中内源性的差异化合物，最后筛选出差异性非极性化合物共2个（见表1-11NO.6-7）。AABC图1-2发生组和未发生组血液非极性代谢物对比A.PCA图，B.PLSDA图，C.火山图Figure1-2comparisonofbloodnon-polarmetabolitesbetweentheoccurrencegroupandthenon-occurrencegroup(A.PCAplot,B.PLSDAplot,c.volcanoplot)3.3组织潜在极性化合物PCA得分图（见图1-3A）所示，化疗性白细胞减少症发生组和未发生组代谢物组间区别不明显，但仍显示两组间代谢物差异的趋势。为了进一步放大两组组间的差异，采用PLSDA的方法进行处理，其PLSDA得分图（见图1-3B）显示，化疗性白细胞减少症发生组和未发生组可以明显的区分。运用Vocanonplot分析（见图1-3C）两组间离子峰的差异，筛选出P<0.05、组间差异FC>1的特征离子峰共74个。通过对比HMDB（人类代谢组数据库）进一步的筛选其中内源性的差异化合物，最后筛选出差异性极性化合物共1个（见表1-12NO.1）。AABC图1-3发生组和未发生组组织极性代谢物对比A.PCA图，B.PLSDA图，C.火山图Figure1-3comparisonoftissuepolaritymetabolitesbetweentheoccurrencegroupandthenon-occurrencegroup(A.PCAplot,B.PLSDAplot,c.volcanoplot)3.4组织潜在非极性化合物PCA得分图（见图1-4A）所示，化疗性白细胞减少症发生组和未发生组之间区别不明显，但仍显示两组间代谢物差异的趋势。为了进一步放大两组之间的差异，采用PLSDA的方法进行处理，其PLSDA得分图（见图1-4B）显示，化疗性白细胞减少症发生组和未发生组可以明显的区分。运用Vocanonplot分析（见图1-4C）两组间离子峰的差异，筛选出P<0.05、组间差异FC>1的特征离子峰共59个。通过对比HMDB（人类代谢组数据库）进一步的筛选其中内源性的差异化合物，最后筛选出差异性非极性化合物共3个（见表1-12NO.2-4）。AABC图1-4化疗性白细胞减少症发生组和未发生组组织非极性谢物对比A.PCA图，B.PLSDA图，C.火山图Figure1-4comparisonoftissuenonpolaritymetabolitesbetweentheoccurrencegroupandthenon-occurrencegroup(A.PCAplot,B.PLSDAplot,c.volcanoplot)表1-11血液中与白细胞减少症潜在相关的化合物Table1-11compoundsinthebloodpotentiallyassociatedwithleukopeniaNOMassRTPolarityLeukopeniaNoLeukopeniaP-valueNameHMDBKEGG.IDClass1755.54549.6290polar201.84±88.9476.24±68.220.0068PC(14:1/20:2)0007913C00157GlycerophospholipidsPC(14:0/20:3)0007882C00157Glycerophospholipids2694.47859.3480polar13.65±5.046.93±7.200.0108PG(12:0/18:0)0116666n/aGlycerophospholipidsPG(14:0/16:0)0116697n/aGlycerophospholipids3399.33415.0810polar15.06±11.338.49±3.930.0338Palmitoylcarnitine0000222C02990FattyAcyls4693.45736.9760polar0.24±0.911.69±2.370.0440PS(14:0/15:0)0112273n/aGlycerophospholipidsPS(15:0/14:0)0112320n/aGlycerophospholipids5228.14710.8350polar15.07±12.0417.58±9.470.0460Leucylproline0011175n/aCarboxylicacidsandderivatives6704.12710.7820Nonpolar2.67±2.460.84±1.090.0195L-Acetylcarnitine0000201n/aFattyAcyls7260.148421.0939Nonpolar12.81±7.356.56±6.330.0452Asparaginyl-Lysine0028736n/aCarboxylicacidsandderivatives表1-12组织中与白细胞减少症潜在相关的化合物Table1-12compoundsintissuespotentiallyassociatedwithleukopeniaNOMassRTPolarityLeukopeniaNoLeukopeniaP-valueNameHMDBKEGG.IDClass1177.13911.3059polar0.12±0.110.05±0.060.0158N-Methylnicotinium0001009n/aPyridinesandderivatives2755.5461495.33179.43603.8999Nonpolar0.17±0.283.73±3.080.71±0.7427.07±29.410.00420.0076PC(14:1/20:2)0007913C00157Glycerophospholipids3NonpolarLysoPC(16:0)0010382C04230Glycerophospholipids4618.521412.2069Nonpolar7.11±8.8617.60±18.310.0356DG(16:1n7/0:0/20:2n6)0056165n/aFattyAcylsDG(14:1n5/0:0/22:2n6)0056147n/aGlycerolipidsDG(18:0/0:0/18:3n3)0056056n/aFattyAcylsDG(18:0/0:0/18:3n6)0056049n/aFattyAcylsDG(16:0/0:0/20:3n6)0056025n/aFattyAcylsDG(16:0/0:0/20:3n9)0056019n/aGlycerolipids618.521412.2069Nonpolar7.11±8.8617.60±18.310.0356DG(20:3(8Z,11Z,14Z)/16:0/0:0)0007475n/aFattyAcylsDG(20:3(5Z,8Z,11Z)/16:0/0:0)0007446n/aFattyAcylsDG(20:2(11Z,14Z)/16:1(9Z)/0:0)0007418n/aFattyAcylsDG(18:3(9Z,12Z,15Z)/18:0/0:0)0007303n/aFattyAcylsDG(18:3(6Z,9Z,12Z)/18:0/0:0)0007274n/aFattyAcylsDG(18:2(9Z,12Z)/18:1(9Z)/0:0)0007247n/aFattyAcylsDG(18:2(9Z,12Z)/18:1(11Z)/0:0)0007246n/aFattyAcylsDG(18:1(9Z)/18:2(9Z,12Z)/0:0)0007219n/aFattyAcylsDG(18:1(11Z)/18:2(9Z,12Z)/0:0)0007190n/aFattyAcylsDG(18:0/18:3(9Z,12Z,15Z)/0:0)0007163n/aFattyAcylsDG(18:0/18:3(6Z,9Z,12Z)/0:0)0007162n/aFattyAcylsDG(16:1(9Z)/20:2(11Z,14Z)/0:0)0007138n/aGlycerolipidsDG(16:0/20:3(8Z,11Z,14Z)/0:0)0007111n/aGlycerolipidsDG(16:0/20:3(5Z,8Z,11Z)/0:0)0007110n/aGlycerolipidsDG(22:2(13Z,16Z)/14:1(9Z)/0:0)0007647n/aGlycerolipidsDG(14:1(9Z)/22:2(13Z,16Z)/0:0)0007059n/aGlycerolipids4讨论在本研究发现血液中潜在极性内源性标志物8个，其中包括磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰甘油-甘油磷脂(PG)、L-棕榈酰、磷脂酰丝氨酸(PS)、亮氨酰脯氨酸五类化合物；血液中发现潜在非极性内源性标志物2个，其中包括L-乙酰、天冬酰胺酰赖氨酸；组织中发现潜在极性标志物N-Methylnicotinium；组织中发现潜在非极性内源性标志物3个，其中包括磷脂酰胆碱、溶血磷脂、甘油二酯三类化合物。上述发现的内源性代谢物中除天冬酰胺酰赖氨酸（有机酸衍生物）和N-Methylnicotinium（有机杂环化合物）外，其余化合物均为脂类。脂类是人体的重要组成成分，参与生命体能量储存和信息的传递ADDINNE.Ref.{7D95801F-CB85-4D32-8A71-631E5F3FA7E8}[12]。在本研究中主要涉及卵磷脂、磷脂酰丝氨酸等甘油磷脂和脂肪酸甘油脂类。PS的含量水平和化疗性白细胞减少症的发生密切相关。DruckerLADDINNE.Ref.{4E047FD1-EBA0-42DE-914A-9C34B901AABB}[13]等研究PS水平与白细胞对细胞毒性药物的反应之间的关系。研究表明结直肠癌患者在接受5-氟尿嘧啶治疗前，其初始PS水平越高，服用化疗药物对白细胞的作用越小，反之亦然。这一研究结果充分的解释了表1-11中白细胞减少症发生组PS水平明显高于未发生组的原因。卵磷脂（PC）是细胞膜结构的重要组成部分，其在细胞周期中的含量与细胞增殖相关。卵磷脂的含量过多或过少都阻碍细胞增殖的正常进行，使细胞停留在细胞周期的某一阶段。ADDINNE.Ref.{5E4AD9EE-EB89-4AFB-B853-60E752A6613F}[14]。在表1-11中白细胞减少症发生组的PC水平显著的高于未发生组，其提示白细胞减少症的发生可能和卵磷脂的含量过高相关。上述发现的潜在内源性标志物在有效鉴别化疗性白细胞减少症的易感人群方面的作用还有待于进一步考察。通过筛选和鉴定可靠的内源性标志物，将其与现有临床检测方法相结合，制定出一套更为完善的不良反应预测方法，有效地鉴别结直肠癌患者中化疗性白细胞减少症的易感人群，对于此类结直肠癌患者提高警惕，密切监测其用药反应和白细胞水平，必要时在化疗同时加用升白药物或换用其他治疗方法可以有效地减少结直肠癌患者接受5-氟尿嘧啶类药物治疗时白细胞减少症的发生。第二部分Chemotherapeuticleukopenia中药复方预防方案的Meta分析1资料与方法 1.1纳入和排除标准1.1.1纳入标准①文献实验设计类型为RCT；②研究对象为结直肠癌诊断明确的患者；③化学治疗方案中必须要包含5-氟尿嘧啶类的化疗药物；④必须使用中药处方或中药制剂来预防化疗性白细胞减少症；⑤结果中必须报告有关白细胞减少症的发生人数或白细胞计数；⑥文献类别限定为期刊。1.1.2排除标准①非临床随机对照实验；②结果中未报告白细胞减少相关数据；③化疗方案中不包含卡培他滨等5-氟尿嘧啶类的化疗药物。1.2检索策略通过计算机检索中国知网(CNKI),维普数据库(VIPDatabase),万方数据库(WanfangDatabase)、中国生物医学数据库(SinoMed)四个常用中文数据库，以Cochrane协作网检索策略规范制定检索策略，以结直肠癌与化疗与（中药或中医药或中草药）为检索词进行主题检索，系统全面收集2001年至2018年公开发表的有关中药预防结直肠癌患者接受5-氟尿嘧啶类化疗药物治疗所致化疗性白细胞减少症的文献资料。1.3纳入研究文献的质量评价标准对所纳入研究的原始文献围绕以下五个方面进行严格无偏倚的质量评价：①是否详细地描述实验随机方法以及所选用的随机分配方法是否正确；②是否报告分配隐藏的情况；③是否采用了盲法及盲法是否正确；④是否详细描述失访及退组的情况；⑤各组间基线情况是否可比性。若基本满足上述标准评为A级；若仅能部分满足上述标准评为B级；若完全不能满足评为C级ADDINNE.Ref.{59B4D588-3088-4DE2-921D-7583A92CEA90}[15]。1.4数据提取提取纳入研究文献重要信息，建立统计表格，包括文献一般信息（论文题目、作者、发表年限）、RCT设计方法（随机分配方法、分配隐藏、盲法、失访及退组）、干预和对照措施（中药药方、服药时机、对照方法、对照药物）、RCT结果、基线情况（患者的年龄、性别、病程等）。1.5资料分析统计方法使用RevMan5.3软件进行分析，统计各临床随机对照实验中对照组和实验组化疗性白细胞减少症的发生人数和总人数，采用x2和I2值对各RCT之间异质性进行检验，以P=0.1、I2=0.5为检验水平。若各RCT间异质性较小(P≥0.1或I2＜0.5)选择固定效应模型；若RCT异质性较大(P＜0.1或I2＞0.5)则选择随机效应模型。结果计量资料采用比值比(OR)表示，区间估计均采用95％CI表示。2结果2.1检索及筛选结果通过1.2中的检索策略共获得4983篇文献，其中中国知网274篇、维普数据库44篇、万方数据库2428篇、生物医学数据库2237篇。根据1.1纳入与排除标准标准初步筛选文献共计73篇。在初筛文献资料中筛选使用同种中药处方或中药制剂且各临床随机对照实验的对照类型、结果表示方法相同的文献资料，最终纳入13篇文献，其中艾迪注射液7篇、康艾注射液2篇、升血汤2篇、君子扶正汤2篇。2.2纳入研究文献质量评价在对照方法方面，13篇文献中平行对照实验均采用空白对照；在随机方法方面，除李明ADDINNE.Ref.{1C8A2BC5-D547-4124-B6EF-6DFFB91E6AEA}[16]2017、许炜茹ADDINNE.Ref.{7B632492-3C24-4397-9F43-4CA2E91A4D65}[17]2015两篇文献明确说明采用随机数字表法以外，其余文献均只提及随机但并未指明随机分配方法；所有文献均未提及分配隐藏、盲法、失访与退组；所有文献基线情况均可比；根据1.4纳入研究文献的质量评价标准，13篇文献质量均为C级。2.3纳入研究文献特征在化疗方案方面，陈宝ADDINNE.Ref.{6E3C0ED9-DF99-4620-9A41-ED1B9C0A826D}[18]2017、樊松ADDINNE.Ref.{18892266-B95A-4D2C-A40B-11E2B0B90332}[19]2010、王冰ADDINNE.Ref.{0A1121F1-E400-4A60-B972-7789712A5CBF}[20]2017、李明2017、周林平ADDINNE.Ref.{AE856F3F-1613-408F-833E-9D8576D1DD9F}[21]2016、雷竹ADDINNE.Ref.{CC1E9F2F-3520-46DC-9D39-49FA175570BD}[22]2012六篇文献采用FOLFOX4方案（奥沙利铂、亚叶酸钙、氟尿嘧啶）；吕遐智ADDINNE.Ref.{A11E1E3E-93F9-4E46-804C-2C3398EBAF8D}[23]2017、施兵ADDINNE.Ref.{27D59D75-30F1-4B97-B3D8-4A0EB686F0CB}[24]2009、姚嵋方ADDINNE.Ref.{02D5A825-6FDE-4768-BC9A-AFA1E910D78F}[25]2016、许炜茹2015四篇文献采用XELOX方案（奥沙利铂、卡培他滨）；吴雪元ADDINNE.Ref.{360CE916-7EDD-41F3-AEF5-532C8E844A03}[26]2012一篇文献采用FOLFIRI方案（伊立替康、亚叶酸钙、氟尿嘧啶）；杨朝流ADDINNE.Ref.{A42BD3D9-6109-47B4-A90E-CC297F0850AF}[27]2012一篇文献采用mFOLFOX6方案（奥沙利铂、亚叶酸钙、5-氟尿嘧啶）；刘涛ADDINNE.Ref.{00BD40DF-9EA4-41E2-AE1B-7B3AA9A31A03}[28]2009一篇文献采用FOLFOX6方案（伊立替康、亚叶酸钙、5-氟尿嘧啶）。在中药服药时机方面，所有干预实验均与化疗同时服用中药；在统计结果方面，所有文献均采用白细胞减少不良反应发生人数或发生率表示。2.4荟萃分析结果2.4.1艾迪注射液共七篇文献使用艾迪注射液预防5-氟尿嘧啶类化疗药物所致的白细胞减少症。实验组共计217人、对照组共计215人。荟萃分析结果表明异质性较小（P=0.67,I2=0%），实验组和对照组间具有统计学差异(OR:0.28,95%CI：0.18-0.43,P<0.00001)，艾迪注射液可以有效降低结直肠癌患者使用5-氟尿嘧啶类药物化疗后白细胞减少症的发生率（见图2-1）。2.4.2君子扶正汤共两篇文献使用君子扶正汤预防5-氟尿嘧啶类化疗药物所致的白细胞减少症。实验组共计75人、对照组共计75人。荟萃分析结果表明异质性较小（P=0.95,I2=0%），实验组和对照组间具有统计学差异(OR:0.20,95%CI:0.10-0.41,P<0.00001)，君子扶正汤可以有效降低结直肠癌患者使用5-氟尿嘧啶类药物化疗后白细胞减少症的发生率（见图2-1）。2.4.3康艾注射液共两篇文献使用康艾注射液预防5-氟尿嘧啶类化疗药物所致的白细胞减少症。实验组共计60人、对照组共计60人。荟萃分析结果表明异质性较小（P=0.91,I2=0%），实验组和对照组间不具有统计学差异(OR:0.52,95%CI:0.20-1.32,P=0.17)，康艾注射液不能降低结直肠癌患者使用5-氟尿嘧啶类药物化疗后白细胞减少症的发生率（见图2-1）。2.4.4升血汤共两篇文献使用升血汤预防5-氟尿嘧啶类化疗药物所致的白细胞减少症。实验组共计90人、对照组共计90人。荟萃分析结果表明异质性较小（P=0.91,I2=0%），实验组和对照组间具有统计学差异(OR:0.42,95%CI:0.20-0.87,P=0.02)，升血汤可以有效降低结直肠癌患者使用5-氟尿嘧啶类药物化疗后白细胞减少症的发生率（见图2-1）。图2-1荟萃分析森林图Figure2-1meta-analysisforestmap3讨论白细胞的生成自造血干细胞(hematopoieticstemcell,HSC)开始，至最终多种白细胞的生成，是一个多步骤过程，受到多种调控因子的影响（图2-2）。HSC具有自我更新和多向分化能力。其自我更新过程受内源性机制（细胞自身调控）和外源性机制（细胞所处微环境中成分调控）共同调控。HSC多向分化可通过多种造血生长因子调控，先分化为共同淋巴样祖细胞和共同髓系祖细胞ADDINNE.Ref.{F2DD7D7C-5EDF-43E8-AD76-0A4B7CDF0613}[29]。前者先分化为成小淋巴细胞，再进一步向B系、T系、NK系分化并最终生成成熟的B淋巴细胞、T淋巴细胞和自然杀伤细胞；后者在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的作用下分化为成髓细胞，成髓细胞进一步分化最终生成成熟的粒细胞（嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、中性粒细胞）和单核细胞ADDINNE.Ref.{FE52E121-F9D6-4D8A-8D67-92C0BE8EC3C9}[30]。图2-2白细胞生成过程图Figure2-2.LeukocytogenesisHSC的多向分化过程受多种造血生长因子的调控。白细胞介素3(IL-3)可以促进多能造血干细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞的增殖和分化ADDINNE.Ref.{B7FE4126-043F-4758-859D-09A1449E3FF2}[31]。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)对造血祖细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞等粒系细胞、单核细胞的生长具有促进作用ADDINNE.Ref.{539ED1B9-FDB0-461C-819E-50068C7F2ED9}[32]，并且能延长造血祖细胞、成熟中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的存活时间，增强其功能。粒细胞集落刺激因子(G-CSF)可促进中性粒细胞的生成和释放，并提升其细胞功能ADDINNE.Ref.{D71D05C3-AE05-4B55-A693-B8CABEF4E1E9}[33]。干细胞因子(SCF)对造血细胞的增殖和分化具有促进作用，可以调控各类血细胞生长，进而促进白细胞的生成。SCF可以刺激最早期造血干细胞的增殖与分化ADDINNE.Ref.{8D9EE4C5-B2A8-4DFC-AE86-F19DF10F4A2A}[34]，能够和多种造血生长因子共同促进白细胞的生成。目前，重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)、IL-3ADDINNE.Ref.{437037A8-F2BF-4ED0-8748-8E20E4E050EE}[9]、SCF已广泛应用于各种原因所致白细胞减少症的治疗。艾迪注射液、君子扶正汤、升血汤的多种成分可以通过影响上述白细胞的生成过程及其调控因子，有效地促进白细胞的生成，从而预防化疗性白细胞减少症的发生。艾迪注射液中包含斑蝥、人参、黄芪、刺五加四味中药材。其中斑蝥有效成分去甲斑蝥素(NCTD)可调控机体骨髓细胞中GM-CSF的表达并影响其在外周血中的分布ADDINNE.Ref.{D33CC88E-3567-4256-B4BC-13FFAFF3A372}[35]，GM-CSF能够促进造血祖细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞等细胞的分化；斑蝥素可以通过缩短白细胞在骨髓成熟的时间并促进其释放,同时可以促进HSC向粒-单核系祖细胞分化,从而增加白细胞数量ADDINNE.Ref.{479E771E-9830-4C78-9AC4-818DE66C0276}[36]；此外，人参中的有效成分人参皂苷可以刺激人体骨髓造血功能增强，进而提高淋巴细胞数量ADDINNE.Ref.{E4B72281-3D86-44BB-B936-84BAAFB8BB99}[37]；黄芪中的有效成分黄芪多糖具有保护保护骨髓的作用，同时可以刺激体外人造血干细胞的增殖和分化，从而促进白细胞的生成ADDINNE.Ref.{AFA211E0-E2E7-483B-904F-AD8EB2A15AEE}[38]；刺五加可以明显地刺激淋巴细胞的增殖，其与增加白细胞数目呈正相关ADDINNE.Ref.{1E948545-6B3C-4D30-94B2-C802C1B46A14}[39]；君子扶正汤中包括人参、黄芪、白术、当归、茯苓、蛇舌草、并头草、炙甘草。除人参、黄芪以外，当归的有效成分当归多糖可以促进人体产生造血调控因子，其对HSC和CFU-GM层的分化具有促进作用，激活骨髓造血功能，促进多种造血祖细胞的分化，进而升高外周血白细胞水平ADDINNE.Ref.{E420CCD2-6214-4222-9B38-ED43EA239D90}[40]。扶正君子汤的其他中药药材尚没有发现有明确治疗白细胞减少症的药理机制。升血方剂中包括太子参、生黄芪、鸡血藤、炒白术、怀牛膝、西洋参、鹿角胶。其中太子参醇可以显著提升白细胞吞噬功能，并能增加外周血白细胞数ADDINNE.Ref.{B5803F33-3FA3-4798-A4DA-EC8DA9D02C44}[40]。鸡血藤当中的活性成分能够刺激造血祖细胞，促进其增殖和分化，进而增加白细胞的数量ADDINNE.Ref.{2F3913DF-1240-4C9E-A4FE-06AECF18C64C}[41]；怀牛膝有效成分牛膝多糖可以有效的预防环磷酰胺所致的白细胞减少症ADDINNE.Ref.{CEF10CA6-4ADC-4FB9-93F6-C2AA593456A6}[42]。西洋参中西洋参根粗多糖(PPQ)对于化疗所致的白细胞减少有明显的抑制作用，还可能通过脾间质细胞增生促进代偿性髓外造血ADDINNE.Ref.{2E35A998-11F2-4882-B15C-A32639A2F977}[43]。尚未有相关文献表明炒白术及鹿角胶具有升白作用。综上所述，艾迪注射液、君子扶正汤、升血汤预防白细胞减少症的机制具有明确药理学研究支撑。艾迪注射液中的斑蝥、人参、黄芪、刺五加，君子扶正汤中的人参、黄芪、当归，与升血方剂中的太子参、生黄芪、鸡血藤、怀牛膝、西洋参都具有直接促进白细胞生成的作用。但尚未有文献明确报道化疗效果是否会受到这些中药处方或制剂的影响。为了有效降低化疗性白细胞减少症发生率，提高化疗安全性，建议在不影响5-氟尿嘧啶类药物化疗效果的前提下，为结直肠癌患者中化疗性白细胞减少症的易感人群使用上述辅助中药方案。以上荟萃分析内容已编撰成文，正在投稿中。结论运用代谢组学的研究方法，在入组结直肠癌患者血液和组织样本中共找到潜在内源性标志物共11个。筛选的潜在内源性标志物主要为脂类，其与化疗性白细胞减少症的发生存在相关性；运用荟萃分析的方法，筛选出有效预防化疗性症的白细胞减少中药处方或制剂共三种，包括艾迪注射液、君子扶正汤、升血汤。通过文献查找，证明有三种中药处方或制剂有明确预防化疗性白细胞减少症的药理机制，推荐临床使用。参考文献[1]杜楠.结直肠癌治疗进展[J].中国癌症防治杂志,2017,9(05):350-355.[2]林丹丹,张一桥,陈能,等.卡培他滨联合奥沙利铂对比氟尿嘧啶联合奥沙利铂治疗结直肠癌疗效与安全性的Meta分析[J].中国肿瘤,2016,25(11):927-932.[3]杨薇.HPLC-MS/MS法同时分析血浆中卡培他滨及其代谢物[D].复旦大学硕士学位论文，2013:5-8.[4]Schwartz,R.N.Anemiainpatientswithcancer:Incidence,causes,impact,management,anduseoftreatmentguidelinesandprotocols[J].AmericanJournalofHealth-SystemPharmacy,2007,64(3Supplement2):S5-S13.[5]陈伟,李明明,姚厚山,等.肿瘤标志物和炎性指标对结直肠癌诊断和化疗不良反应预测的临床价值[J].肿瘤,2018,38(11):1038-1047.[6]田劭丹,董青,祁烁,等.化疗后白细胞减少症中医药防治与评估专家共识[J].现代中医临床,2018,25(03):1-6.[7]林玉冰,黎静.穴位按摩、中药对结直肠癌化疗患者白细胞减少的效果观察[J].内蒙古中医药,2018,37(02):70-71.[8]戚文娟,田雪娇,周长江.代谢组学在结直肠癌中的研究进展[J].医学与哲学(B),2013,34(06):62-64.[9]刘亚坤,张洪亮.恶性肿瘤化疗所致粒细胞减少的防治进展[J].新疆中医药,2018,36(04):130-132.[10]马晓兰,陶可胜,李静.肿瘤化疗后白细胞减少症的中西医治疗进展[J].中国当代医药,2015,22(08):16-19.[11]马晓兰,陶可胜,李静.肿瘤化疗后白细胞减少症的中西医治疗进展[J].中国当代医药,2015,22(08):16-19.[12]陈明玉.脂类物质的生物学功能与人体保健[J].科技信息(科学教研),2007(19):34.[13]Drucker,L.,etal.,Initialexposedphosphatidylserinelevelscorrelatewithcellularresponsetocytotoxicdrugs.EurJHaematol[J],2003.70(2):98-105.[14]常平安,秦文珍,魏进民.卵磷脂与细胞周期[J].中国生物化学与分子生物学报,2006(12):947-952.[15]王妍,马怀幸,刘天舒.重组人血小板生成素治疗肿瘤化疗所致血小板减少症的荟萃分析[J].循证医学,2013,13(04):225-229.[16]李明.君子扶正汤对结直肠癌术后化疗患者生存质量及免疫功能的影响[J].中国合理用药探索,2017,14(10):8-10.[1