生物安全实验室操作技术规范

生物平安实验室操作技术标准实验室感染的传播链个人防护装备容器中的病原体泄漏预防接种感染途径/感染剂量传播易感宿主规程/设备潜伏期医学监测规程/设备生物平安防护实验室硬件：实验室的设计建造设备的配置个人防护装备软件：严格的管理规程良好的操作规程1.所有操作人员必须经过培训，通过考核，获得上岗证书；2.在开始相关工作之前， -对所从事的病原微生物及相关操作进行危险评估， -根据国家对于各种微生物操作的危险等级划分和防护要求以及危险评估的结果，制定全面、细致的标准操作规程和程序文件，对于关键的危险步骤设计出可行的防护措施并掌握其细节；3.熟悉各级生物平安实验室运行的一般规那么，掌握各种仪器、设备、装备的操作步骤和要点，对于各种可能的危害应非常熟悉；4.掌握各种感染性物质操作的一般准那么和技术要点。生物平安意识至关重要实验室的生物平安标准实验室的运行标准仪器设备的使用标准针对感染性材料的操作标准个人防护用品的使用标准……第一节 病原微生物实验室的生物危险微生物气溶胶吸入刺伤、割伤皮肤、黏膜污染食入感染的实验动物咬伤……不明原因的实验室相关感染Pike等对3921例实验室相关感染统计分析： -原因的实验室感染只占全部感染的18％； -不明原因的实验室感染却高达82％。对不明原因的实验室感染的研究说明： 大多数可能是因病原微生物形成的感染性生物气溶胶在空气扩散，实验室内工作人员吸入了污染的空气感染发病。分散相内含有微生物的气溶胶称之为生物气溶胶病原微生物实验室相关感染的途径〔1〕

表9-1〔p.78〕病原微生物实验室相关感染的途径〔2〕病原微生物实验室相关感染的途径〔3〕一.实验室微生物气溶胶的种类飞沫核气溶胶粉尘气溶胶两类微生物气溶胶对实验室工作人员都具有严重的危害性，其程度取决于微生物本身的毒力、气溶胶的浓度、气溶胶粒子大小、以及当时实验室内的微小气候条件。-粒径大于100m沉降很快；〔实验室感染的可能性小〕-粒径小于50m在0.4s内就扩散开；-粒径大于5m能够被呼吸道的粘膜捕获。 〔冻干培养物-80%〕-粒径小于5m吸入后，可到达肺深部的肺泡处；(搅拌器粉碎器-98%、吹吸混匀、离心、超声粉碎、摔碎菌液瓶)二.各种实验操作造成实验室感染的危险性

表9-2可产生各种严重程度微生物气溶胶的实验室操作(p.80)产生微生物气溶胶的其它因素一些在自然环境中可以繁殖的微生物，一旦进入实验室的空调或通风系统，污染空调冷却水，可形成更广泛的微生物气溶胶污染。患有呼吸道传染病或皮毛上染有病原微生物的实验动物也可以产生微生物气溶胶。微生物气溶胶在一个实验室内产生后，还可以通过气流转移到同一建筑物的其他地方，甚至污染整个建筑物的空气。第二节 生物平安实验室的运行标准LaboratoryBiosafetyManual 3rdedition-labcommissioningandcertification-labbiosecurityconceptsBiosafety:Topromotetheuseofsafepracticesinthehandlingofpathogenicmicroorganisms

inthelaboratoryduringtransportationinfieldinvestigationsinmanufacturingfacilitiesinhealth-carefacilitiesLaboratoryBiosafetyManual1steditionWHOLaboratoryBiosafetyManual-translatedintoF,S,P,Ch,Ru-availableonweb,CD-Rom,hardcopies1983199320032004需结合国家法规、要求和我国具体情况一.BSL-1和BSL-2实验室未经批准，任何人不得进入实验室工作区域。儿童不得进入实验室工作区域。可能增加获得性感染的危险性或感染后可能引起严重后果的人员不允许进入实验室或动物房。BSL-2实验室门上应标有国际通用的生物危害警告标志，包括通用的生物危险性标志，标明传染因子、实验室负责人或其他人姓名、、以及进入实验室的特殊要求。实验室的门应保持关闭。工作人员进入动物房应当经过特别批准。与实验室工作无关的动物不得带入实验室。〔一〕实验室的进入1.在实验室工作时，必须穿着适宜的工作服或防护服。2.在进行可能接触到血液、体液以及其他具有潜在感染性的材料或感染性动物的操作时，应戴上适宜的手套/双层手套。手套用完后，应先消毒再摘除，随后必须洗手。3.在处理完感染性实验材料和动物后，以及在离开实验室工作区域前，都必须洗手。4.为了防止眼睛或面部受到喷溅物的污染、碰撞或人工紫外线辐射的伤害，必须戴适宜的平安眼镜、面罩〔面具〕或其他防护设备。〔二〕工作人员的防护要求5.严禁穿着实验室防护服离开实验室工作区域。6.不得在实验室内穿露脚趾的鞋。7.禁止在实验室工作区域进食、饮水、吸烟、化装和处理隐形眼镜。8.禁止在实验室工作区域储存食品和饮料。9.在实验室内用过的防护服不得与日常服装放在同一柜子内。办公室〔三〕有关操作的指导原那么1.严禁用口吸移液管、将实验材料置于口内、或舔标签；2.所有的实验操作尽量减少气溶胶和微小液滴的形成；3.应限制使用注射针头和注射器。除了进行肠道外注射或抽取实验动物体液外，注射针头和注射器不能用于移液或用作其他用途；4.实验室应制订并执行处理溢出物的标准操作程序。

-出现溢出、事故以及明显或可能暴露于感染性物质时，处理后，必须向实验室负责人报告；

-实验室应如实记录有关暴露和处理情况，保存相关记录；5.污染的液体在排放到生活污水管道以前必须去除污染〔采用化学或物理学方法〕。根据所处理的微生物因子的危险度评估结果准备专门的污水处理系统。6.只有保证在实验室内没有受到污染的文件纸张才能带出实验室〔四〕实验室工作区的管理原那么1.实验室应保持清洁整齐，严禁摆放和实验无关的物品。2.每天工作结束后应去除工作台面的污染。假设发生具有潜在危害性的材料溢出应立即去除污染。3.所有受到污染的材料、标本和培养物在废弃或清洁再利用之前，必须先去除污染。4.感染性材料的包装和运输应遵循国家和∕或国际相关规定。5.如果窗户可以翻开，那么应安装防止节肢动物进入的纱窗。1.实验室负责人负责制订和采用生物平安管理方案以及实验室平安或/和操作手册。2.实验室应能提供常规的实验室平安培训,并建立制度。3.实验室负责人〔或生物平安负责人〕要将生物平安实验室的特殊危害告知实验室人员， -阅读生物平安或/和操作手册，并遵循标准的操作程序。 -实验室内应备有可供取阅的平安或/或操作手册。 -所有实验室人员必须经过培训，了解所从事工作的危险、掌握有关的管理规定和操作程序，通过考核前方可从事相关实验室工作。〔五〕生物平安管理的指导原那么4.应当制订节肢动物和啮齿动物的控制方案。5.如有必要，应为所有实验室人员提供适宜的医学评估、监测和治疗，并建立健康档案。实验室人员应接受与所操作生物因子或实验室内潜在的因子相关的免疫接种或检测。二.BSL-3实验室1.BSL-3的使用应符合?病原微生物实验室生物平安管理条例?的有关规定。2.张贴在实验室入口门上的国际生物危害警告标志,应注明生物平安级别以及管理实验室出入的负责人姓名，并说明进入该区域的所有特殊条件，如免疫接种状况等。3.实验室防护服应为长袖、反面开口的隔离衣或连体衣，应穿着鞋套或专用鞋。实验室防护服不能在实验室外穿着，且必须在去除污染后再清洗。最好使用一次性连体防护服。4.开启各种潜在感染性物质的操作均必须在生物平安柜或其他类似的防护设施中进行。5.有些实验室操作，或在进行感染了某些病原微生物的动物操作时，必须配备呼吸防护装备。6.实行双人工作制，严禁任何人单独在实验室内工作。7.实验记录未经可靠消毒不得带出实验室。通常使用进行原始记录的传输。8.工作人员应开展健康监测。应收集并妥善保存工作人员的基线血清〔分装、保存〕、并定期体检和采集血清。9.每天早、晚测体温，有相应的体征或身体不适者不宜进入实验室工作BSL-3实验室BSL-2以上实验室的实验人员：身体状况良好不应进入者：发热、妊娠、其他因素造成的抵抗力低下 已在实验室控制区连续工作4h以上 其他原因造成的疲劳状态第三节 生物平安柜的使用标准每次使用前检查不翻开观察窗列出工作所需物品的清单，以减少双臂进入破坏气流翻开风机5-10min窗式报警器、气流报警器任何造成平安柜内气流紊乱的不良操作都会危及操作者的平安一.操作准备二.物品摆放与污染措施尽量少放仪器和物品不要阻塞气口的空气流通废物容器/袋置安全柜内 密封 消毒安全柜内洁净物品/污染物品分开放置（消毒巾的垫置）操作尽量工作台中央，注意动作对定向气流的影响工作用纸不允许放在生物安全柜内尽量减少操作者背后人员的走动、快速开关实验室的门 （进入时，敲门提醒正在操作的人员）8.禁止使用本生灯/酒精灯，紫外灯不是必需的洁净物与污染物分开放置生物平安柜内感染性材料溢洒的处理当发生少量溢洒时，应用吸收纸巾立即处理，并立即用浸满消毒液的毛巾或纱布对生物平安柜及其内部的所以物品进行擦洗。工作面消毒后应更换手套，不管是摘下手套还是更换手套都要消毒洗手。假设发生大量溢洒，液体会通过生物平安柜前面或后面的格栅流到下面去，生物平安柜内所有的物品都应该进行外表消毒并拿出生物平安柜，在确保生物平安柜的排水阀被关闭后，可将消毒液倒在工作台面上，使液体通过格栅流到排水盘上。所有接触溢出物品的材料都要进行消毒和/或高压灭菌处理。生物平安柜污染的去除〔1〕☆在实验结束时，包括仪器在内的生物平安柜里的所有物品应去除外表污染后，才能移出平安柜；☆在每次使用前后去除生物平安柜内外表的污染，工作台面和内壁要用消毒剂进行擦拭〔杀灭任何微生物〕，但不包括送风滤器的扩散板；☆在每天实验结束时，应擦拭生物平安柜的工作台面、四周以及玻璃的内外侧等部位以去除外表的污染。☆在对目标生物体有效时，可以采用漂白剂溶液或70%酒精来消毒。在使用如漂白剂等腐蚀性消毒剂后，还必须用无菌水再次进行擦拭。☆研究试剂溢漏或泼洒后，立即去除污染物及污染的外表☆在更换HEPA过滤器或内部维修之前，必须对已用于感染性材料工作的生物平安柜进行消毒☆在生物平安柜维护、更换过滤器、以及性能测试或重新安置之前，必需消毒☆最普通的气体消毒方法：甲醛熏蒸☆推荐将平安柜一直维持运行状态。如果要关闭的话，那么应在关机前运行5min以净化内部的气体。生物平安柜污染的去除〔2〕禁用非必需工作台面和内壁要用消毒剂进行擦拭不要擦拭送风滤器的扩散板！！！第四节 实验室仪器设备的使用标准仪器使用中的相关危险干燥器爆裂、瓶子碎片和感染性物质飞出培养物搅拌器，混合器，搅拌器产生气溶胶、喷溅和溢出皮下注射针头意外接种产生气溶胶或感染性物质溢出离心机产生气溶胶、溅出和管子破裂超速离心机管子破裂高速搅拌器，组织匀浆器飞沫、渗漏和容器破裂超声波破碎机、超声波清洁器产生气溶胶、听力受损、皮炎冻干机（冷冻干燥机）产生气溶胶、直接接触污染水浴微生物生长，叠氮化钠和一些金属形成爆炸复合物1.为防止感染，严禁用嘴吸液。应使用机械移液装置。2.所有的吸管都应该有棉塞以减少对移液器或吸球的污染。建议使用带有滤芯的吸头。在BSL-2及以上级别实验室中，最好防止使用玻璃吸管。3.对于感染性材料不能用吸管吹打来到达混匀的目的，操作时吸管应放入操作液面下的三分之二处，以防止产生气泡和气溶胶。从吸管吹出液体时也不要太用力，吸管内的液体应自动流出，不要强制性排出预留液。4.污染的吸管应立即浸没在含有适宜的消毒剂的防破碎的容器里。在处理之前，应浸泡足够长的时间。 盛装废弃吸管的容器〔不锈钢盒子〕应放在生物平安柜里5.严禁用带有注射针头的注射器吸液6.为防止从吸管滴落的感染性物质发生扩散，工作台外表应放一块具有吸收性能的材料，使用后应按感染性废弃物予以处理。一.吸管和移液器的使用二.离心机的使用离心分类

转头转速（rpm）

微速离心

～15,000

低/高速离心

2,000～20,000

超速离心

～120,000

离心可能造成的伤害途径

离心机机械故障实验器材故障，如离心管等产生气溶胶；操作者失误。1.所有离心机应处于正常工作状态/合格机械性能，根据厂家说明书进行操作。2.离心机位于适宜位置和高度，工作人员能看见离心桶，便于进行各项操作。3.离心管和标本容器根据厂家要求选用，最好使用塑料制品，使用前应检查有无破损。必须在平安柜内翻开盖子。4.使用转头时应注意转头盖与转头型号是否匹配。离心桶的装载、平衡、密封和翻开必须在生物平安柜内进行。空离心桶配平时应该用蒸馏水或70％乙醇、异丙醇，不应使用盐水和次氯酸盐溶液。离心管内液面水平距管口应留出一定空隙，以确保离心过程中液体不会溢出，尤其是使用角转头时更要注意。〔密封的离心桶/平安杯〕5.应该每天检查在特定的转速下，离心杯的内外表有无污物。离心转头和离心桶应每天检查有无腐蚀点以及极细的裂缝，以确保平安。离心桶、转头和离心机腔每次用后都应该消毒。每次用后，应该把离心桶倒放，以排净离心配平的液体。对于高致病性病原微生物，必须要高度警惕离心过程中产生的气溶胶风险。－大型离心机上应加装负压罩，以及时吸出离心机排出的气体，并排至实验室的过滤通风系统，在BSL-3及以上级别实验室尤其要注意。－所有的离心管必须带盖密封，其开启应在平安柜内进行。－微型离心机那么可放在平安柜内离心，但要注意其对平安柜气流的影响。－如果不能在平安柜内离心也无负压罩，那么必须将密封的转头在平安柜内翻开。

三.搅拌器、振荡器、混匀器和超声波破碎仪的使用

1.使用的管子、盖子、杯子或瓶子都应该保持完好，无裂隙、无变形。盖子、垫圈应恰好配套，保持完好。2.在混匀、振荡和超声波破碎过程中，器皿内的压力会增大，含有感染性材料的气溶胶可能会沉着器和盖子间的空隙逸出。推荐使用塑料的，特别是聚四氟乙烯〔PTFE〕器皿，因为玻璃可能会破裂。3.当使用匀浆器、振荡器和超声波破碎仪时，应有防护装置，在生物平安柜里操作。使用涡旋振荡器时，必须在生物平安柜内操作，操作的容器必须为密闭的，以防止产生气溶胶和发生液体溅洒。4.在操作结束后，应在生物平安柜里开启容器。5.操作人员使用超声波破碎仪时，应有耳部听力保护装置。四.组织研磨器的使用使用玻璃的研磨器时，应戴上手套，手里再垫上一块柔软的纱布后操作。塑料〔PTFE〕的研磨器更平安。组织研磨器应该在生物平安柜里操作和开启。五.冰箱和速冻器的使用和保养冰箱、低温冰箱和固体干冰盒要定期除霜和清扫。 及时去除在贮存过程中已破裂安瓿、冻存管。在清扫的过程中应注意防护,配戴面部保护装置并戴手套。清扫后进行消毒处理。2.保存在冰箱里的容器等，都应有清楚的标签，标注内容物的科学命名、贮存日期和贮存人姓名。无标签的和过期的材料应高压灭菌后丢弃。对于冰箱内的储存物应有详细的目录。3.除非有防爆措施，严禁将易燃液体保存在冰箱里，冰箱的门上应张贴这方面的本卷须知。六.冻干机的使用1.对于高致病性病原微生物应在BSL-3或以上级别实验室进行冻干。2.冻干机排出的气体要经过HEPA过滤并将排出管道插入装有消毒液的容器中。3.对于冻干高致病性病原微生物产生的冷凝水应收集入消毒液容器中并高压灭菌处理。4.冻干机的机舱恢复到室温后用适宜的消毒液擦拭。表9-3可能产生危害的微生物操作相关仪器设备和消除/降低危险的方法第五节 感染性材料的操作与防护标准一.实验室内标本的平安操作〔一〕标本容器1.用于装盛感染性标本的容器可以是玻璃的，但为了保证平安，最好采用塑料制品〔根据实际需要而定〕。2.标本的容器应当巩固，不易破碎，盖子或塞子盖好后不应有液体渗漏。所有的标本都应存放在容器内。3.容器应正确地贴上标签以利于识别，标签上应有样品名称、采集日期、编号等必要的信息。4.样品的有关表格和/或说明不要绑在容器外面，而应单独放在防水的袋子里，以防止发生污染而影响使用。〔二〕标本的实验室内运输为防止发生意外渗漏或溢出，在实验室内运输标本时，应使用金属的或塑料材质的第二层容器〔如盒子〕。 --第二层容器中应该有标本容器的支架，将标本容器固定在支架上，以使其保持直立； --第二层容器应耐高压或者能抵抗化学消毒剂的腐蚀，以便定期去除污染。 --容器封口处最好有一个衬圈，以防止发生渗漏。〔三〕标本的接收1.大规模接收标本的实验室应在专用的房间或区域进行。2.对于病原的按国家规定可在BSL-2操作的病原微生物或未知的感染性材料，最低应在一个专用区域或房间接受，并在生物平安柜内翻开外包装，操作人员应穿防水的防护服，戴生物平安专用口罩和眼罩、手套。3.按国家规定需要在BSL-3或以上级实验室操作的病原微生物或标本，应按国家规定的防护等级，在相应级别的实验室的平安柜内翻开，并采取相应的防护措施为保证平安。4.不应在普通的BSL-1实验室接受标本。〔四〕标本包装的翻开1.接收并翻开标本包装的人员应受过防护培训〔尤其是处理破裂的或渗露的容器〕并应知道所操作标本的潜在的健康危害，操作时要采取适宜的防护措施。2.所有标本应该在生物平安柜里翻开包装，同时备有消毒剂以便随时处理可能出现的标本泄漏。翻开包装前应先仔细检查每个容器的外观、标签是否完整，标签、送检报告与内容物是否相符，是否有污染以及容器是否有破损等，要登记详细的报告单并记录处置方法。3.接受标本应由2人进行。二.防止感染性物质扩散的方法1.为防止接种物从接种环上脱落，微生物接种环直径应为2～3mm并且完全闭合，柄的长度不应超过6cm以最大限度减少抖动。2.应该使用密闭的微型电加热灭菌接种环，〔不用本生灯〕。最好使用一次性的、无需灭菌的接种环。3.小心操作枯燥的痰标本，以免产生气溶胶。4.要高压灭菌和/或丢弃的废弃的标本及培养物应放在防渗漏的容器里，如实验室用的医疗废物专用袋，这些袋子是耐高压的。 高压消毒后放入废弃物容器前，标本的顶部应标明是平安的〔如用高压标签〕。5.应对实验室进行定期的消毒。三.防止感染性物质吸入或接触的标准1.在微生物学的实验操作中释放的较大颗粒和小液滴〔直径大于5μm〕会很快落在操作台外表以及操作者的手上，为了防止污染，操作者应戴一次性手套。实验人员做实验时要防止触摸嘴、眼和面部。2.严禁在实验室里吃东西、喝东西以及储存食品和饮料。3.实验室内不许咬笔、嚼口香糖。4.实验室内不许化装和配戴隐形眼睛。5.在任何可能导致潜在的传染性物质溅出的操作过程中，应该保护面部、眼睛和嘴。四.防止传染性物质接种的标准1.要尽力防止由破裂的或有缺口的玻璃器皿引起的传染性物质的意外感染。尽量以塑料器皿代替玻璃器皿。应用塑料吸管替代玻璃吸管。2.锐器皿如皮下接种针〔针头〕、玻璃吸管和碎玻璃可导致实验人员感染，因此锐器要小心操作。3.为减少注射器和针头造成的意外事故，应尽量少用注射器和针头〔可以用简单的工具开启瓶塞，这样就可以用吸管代替注射器和针头〕。必须使用注射器和针头时，要采用锐器保护装置。注射器的使用标准不要用注射器代替移液管不要重新给针头盖帽或夹针头。使用针头锁定型注射器，以防针头和注射器别离，或者使用一体的一次性注射器。运用正确的实验室技术，如：—吸液时要小心，尽量减少吸液体时产生气泡—防止使用注射器混匀感染性的液体；如果使用，保证针的端部在容器的液面下，并且不要太用力—从胶塞瓶中拔出针管前，要用适当的抗感染材料浸湿的脱脂棉包裹针头和塞子。—不允许向空气中直接排放注射器的气泡，将多余的液体或气泡推入用抗感染材料浸湿的脱脂棉或有脱脂棉小瓶中。感染性材料的所有操作都要在生物平安柜中进行。对动物进行接种时要固定。滴鼻或者口腔接种时，使用钝的针头或套管，并在生物平安柜中操作。使用后用专用容器收集高压灭菌，妥善处理。五.血清别离的实验技术标准1.操作时要戴手套及配戴眼睛和粘膜保护装置。2.只有良好的实验室技术才能防止溅出和气溶胶产生，或将这种可能性降至最低。吸取血液及血清时要小心，不要倾倒。严禁用嘴吸液。3.吸管用后应完全浸没在适当的消毒液里，并且在处理之前，或洗刷及灭菌再利用前要浸泡足够长的时间。4.带有血凝块的废弃标本管等，加盖后应当放到适当的、防渗漏的容器中，以备高压和/或燃烧。5.应备有适宜的消毒液，用以随时去除溅出物及溢出物。六.开启含冻干传染性物质安瓿的技术标准1.首先消毒安瓿的外外表。2.安瓿里如果有棉塞或纤维塞，应先用砂轮在安瓿外外表的棉塞或纤维塞中部